Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация для анализа субпопуляций Т-клеток, устойчивых к иммунотерапии

Возьмем криосекцию ткани почечно-клеточной карциномы, в которой инфильтрируются CD8+ Т-клетки в микроокружении опухоли.

Обработайте его ацетоном для фиксации и пропитки тканей. Умойтесь, чтобы удалить излишки ацетона.

Добавляйте авидин для насыщения эндогенных тканей биотином. Затем добавьте биотин для блокирования иммобилизованных авидин-связывающих сайтов, сводя к минимуму неспецифические взаимодействия.

Применяйте сыворотку, содержащую иммуноглобулины, для блокирования Fc-рецепторов иммунных клеток, предотвращая связывание неспецифических антител.

Добавьте первичный коктейль антител, нацеленный на CD8, цитотоксический маркер Т-клеток, и PD-1 и Tim-3, ингибирующие рецепторы, экспрессируемые субпопуляциями CD8+ Т-клеток, устойчивыми к иммунотерапии.

Введение различных меченых флуорофорами вторичных антител, нацеленных на антитела против CD8 и анти-Tim-3.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела, нацеленные на антитела против PD-1, и другой меченный флуорофором стрептавидин связывается с биотином.

Нанесите на ядра клеток краситель, содержащий краситель, и установите покровную крышку.

Получение мультиспектральных флуоресцентных изображений для идентификации инфильтрирующих опух