Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация для анализа субпопуляций Т-клеток, устойчивых к иммунотерапии

Возьмем криосекцию ткани почечно-клеточной карциномы, в которой инфильтрируются CD8+ Т-клетки в микроокружении опухоли.

Обработайте его ацетоном для фиксации и пропитки тканей. Умойтесь, чтобы удалить излишки ацетона.

Добавляйте авидин для насыщения эндогенных тканей биотином. Затем добавьте биотин для блокирования иммобилизованных авидин-связывающих сайтов, сводя к минимуму неспецифические взаимодействия.

Применяйте сыворотку, содержащую иммуноглобулины, для блокирования Fc-рецепторов иммунных клеток, предотвращая связывание неспецифических антител.

Добавьте первичный коктейль антител, нацеленный на CD8, цитотоксический маркер Т-клеток, и PD-1 и Tim-3, ингибирующие рецепторы, экспрессируемые субпопуляциями CD8+ Т-клеток, устойчивыми к иммунотерапии.

Введение различных меченых флуорофорами вторичных антител, нацеленных на антитела против CD8 и анти-Tim-3.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела, нацеленные на антитела против PD-1, и другой меченный флуорофором стрептавидин связывается с биотином.

Нанесите на ядра клеток краситель, содержащий краситель, и установите покровную крышку.

Получение мультиспектральных флуоресцентных изображений для идентификации инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток и устойчивых к иммунотерапии субпопуляций, экспрессирующих PD-1, Tim-3 или и то, и другое.

После размораживания используйте бумажное полотенце, чтобы тщательно высушить предметные стекла вокруг участков ткани, и обведите ткани гидрофобной барьерной ручкой. Когда барьер высохнет, зафиксируйте образцы в 100% ацетоне на 5 минут, после чего последует 2 минуты сушки на воздухе. Затем промойте слайды в TBS в течение 10 минут.

Предварительно обработайте предметные стекла тремя каплями 0,1% авидина в течение 10 минут в темноте. Затем коснитесь или проведите по предметным стеклам, чтобы покрыть ткань раствором авидина. Добавьте три капли 0,01% биотина в каждый образец и постучите или проведите биотином по образцам, а затем промойте их TBS, как показано выше. Затем заблокируйте любое неспецифическое связывание 100 микролитрами 5% нормальной сыворотки в TBS в течение 30 минут при комнатной температуре.

В конце инкубации постучите по предметным стеклам, чтобы удалить излишки сыворотки, и инкубируйте предметные стекла в 100 микролитрах основного коктейля антител, который представляет интерес, в течение 1 часа во увлажненной камере. Промойте предметные стекла, помеченные антителами, в TBST в течение 5 минут.

После сушки пометьте клетки 100 микролитрами интересующего коктейля вторичных антител в течение 30 минут в увлажненной камере, после чего в течение 10 минут промывайте TBS. Инкубируйте высушенные предметные стекла, меченные вторичными антителами, со 100 микролитрами интересующего коктейля третичных антител в течение 30 минут, после чего следует заключительная 10-минутная промывка TBS.

В конце промывки высушите слайды и закрепите салфетки с помощью монтажного материала, дополненного DAPI. Затем накройте каждое слайд защитным накладкой и дайте монтажному материалу застыть не менее 2 часов.

Чтобы отсканировать слайды, откройте программное обеспечение микроскопа и загрузите протокол сканирования изображений. Загрузите первое предметное стекло на предметный столик микроскопа. Затем на панели управления нажмите «Установить экспозицию» и отрегулируйте время экспозиции для каждого фильтра до тех пор, пока не будет получен достаточный, но не насыщающий сигнал.

Нажмите «Пуск» на верхней панели и откройте папку с идентификатором лаборатории. Введите идентификатор первого слайда и нажмите «Далее».

Чтобы получить обзор предметного стекла при ярком поле света с 4-кратным увеличением, нажмите «Монохромное изображение» и «Найти образец». Чтобы выбрать область ткани для сканирования, нажмите клавишу Control и с помощью курсора выберите или отмените выбор интересующих областей для сканирования с 4-кратным увеличением.

Чтобы получить флуоресцентное красно-сине-зеленое изображение каждой области, щелкните Маломощная визуализация. Для выбора поля с высокой мощностью нажмите клавишу Control и выберите не менее пяти областей интереса, которые соответствуют областям ткани, которые будут сканироваться с 20-кратным увеличением.

Затем, чтобы получить мультиспектральное изображение для каждого поля, нажмите кнопку High-Power Imaging, а затем нажмите кнопку Data Storage, чтобы сохранить изображения в соответствующей папке lab ID.