Иммунофлуоресцентный метод локализации вирусных белков в инфицированных клетках

Начните со предметного стекла, содержащего прилипшие клетки-хозяева.

Добавьте вирусы и позвольте им проникнуть в клетки-хозяева.

Удалите отработанное средство. Добавьте свежую среду для синтеза и транспортировки вирусного белка.

Используйте параформальдегид для сохранения морфологии клеток и расположения белка.

Добавьте молекулы детергента, чтобы сделать клетки проницаемыми.

Применение буфера блокировки для блокировки сайтов, не являющихся целевыми привязками.

Добавьте первичные антитела, которые связывают целевые вирусные белки. Удалите несвязанные антитела.

Наложение на красные флуорофор-конъюгированные вторичные антитела для флуоресцентного мечения вирусных белков. Удалите несвязанные антитела.

Добавьте флуоресцентную ядерную красительную среду для окрашивания ядер.

С помощью конфокальной микроскопии наблюдайте за расположением красных флуоресцентных вирусных белков и синих флуоресцентных ядер хозяина.

Более сильный красный сигнал вокруг синей области указывает на цитоплазматическую локализацию, в то время как более сильный сигнал внутри указывает на ядерную локализацию.

Равные уровни сигнала в синей области и вокруг нее указывают на то, что белки расположены как в ядре, так и в цитоплазме.

За 20-24 часа до заражения вирусом засейте 5 x 10⁴ эмбриональных клеток легкого человека или фибробластов HEL в лунку на 4-луночное 11-миллиметровое горло в шахматном порядке питательную среду для ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.

Важно тщательно раскачивать предметное стекло, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, при этом следя за тем, чтобы питательная среда не пролилась. На следующий день замените надосадочную жидкость от 70% до 80% конфлюентных культур на Medium-199, содержащую 4-10 бляшечных единиц на клетку, и поместите предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием на 1 час.

По окончании инкубации замените надосадочную жидкость свежей питательной средой и верните клетки в инкубатор на соответствующий экспериментальный период заражения. Для иммунофлуоресцентного окрашивания инфицированных вирусом клеток необходимо быстро промыть клетки три раза PBS с последующей 8-10-минутной инкубацией в 200 микролитрах 4% параформальдегида в PBS на лунку. По окончании фиксации трижды промыть клетки 200 микролитрами PBS на промывку и проникнуть в клетки 100 микролитрами 0,2% неионогенного поверхностно-активного вещества на лунку в течение 5-10 минут.

Промойте пермеабилизированные клетки три раза в PBS, как показано на рисунке, и добавьте 200 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку для 1-часовой инкубации при комнатной температуре. Затем добавьте соответствующую концентрацию первичного антитела, представляющего интерес, в каждую лунку для 2-часовой инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации удалите все несвязанные первичные антитела тремя 10-минутными промывками в свежем блокирующем буфере и добавьте соответствующее вторичное антитело в каждую лунку для 1-часовой инкубации при комнатной температуре, защищенной от света.

В конце инкубации промойте клетки три раза в блокирующем буфере, как показано на рисунке, а затем одну промывку в PBS, и добавьте в каждую лунку по одной капле монтажной среды, препятствующей выцветанию, с добавлением DAPI. Затем наденьте покровное стекло на предметное стекло и заклейте его прозрачным лаком для ногтей.

Мягкое давление при установке покровного стекла удалит лишнюю монтажную среду, что поможет обеспечить получение высококачественных изображений.

Чтобы проанализировать ядерное и цитоплазматическое распределение ICP0, откройте проект в конфокальной прикладной программе и выберите изображение. Откройте вкладку «Количество» и выберите «Сортировать области интереса» в меню «Инструменты». Выберите «Нарисовать линию» и проведите продольную линию поперек анализируемой клетки. Появится гистограмма, показывающая интенсивность флуоресценции вдоль линии как для интересующего белка, так и для DAPI.

На основе фонового окрашивания установить постоянный порог интенсивности интересующего белка для анализа субклеточного распределения белка в каждом эксперименте. Если сигнал белка, в среднем, ниже порога в ядерной области, но выше порога за границей DAPI, классифицируйте сигнал белка как преимущественно расположенный в цитоплазме.

Если сигнал белка находится выше порога по всему ядру и за границей сигнала DAPI, сгруппируйте сигнал белка как ядро плюс цитоплазматическая локализация. Если сигнал белка находится выше порога в ядре, но в среднем ниже порога за пределами границы сигнала DAPI, сгруппируйте сигнал белка как ядерную локализацию.