Метод in vitro для идентификации врожденных и адаптивных иммунных клеток, обитающих в легких мышей
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 5:54 мин • July 8th, 2025
Возьмите измельченную мышиную легочную ткань в буфере для пищеварения и инкубируйте при физиологической температуре.
Буферные ферменты разрушают тканевый матрикс, разрыхляя клетки.
Растирайте для диссоциации клеточной массы и фильтруйте суспензию с помощью ситечка для изоляции отдельных клеток.
Центрифуга для удаления надосадочной жидкости с остатками тканей. Инкубируйте клетки с буфером для лизиса, чтобы лизировать эритроциты.
Центрифуга для удаления надосадочной жидкости, содержащей клеточный мусор. Ресуспензируйте клетки и перенесите их на микропланшет.
Добавьте антитела для блокировки Fc-рецепторов, предотвращая фоновое окрашивание.
Введение меченого флуорофорами коктейля антител, нацеленного на специфические поверхностные маркеры на клетках врожденного иммунитета — моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, естественных киллерах, нейтрофилах, эозинофилах и адаптивных иммунных клетках — В- и Т-лимфоцитах.
Фиксируют и проникают в клетки. Добавьте меченные флуорофорами антитела, специфичные к внутриклеточному маркеру на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и эозинофилах.
С помощью проточной цитометрии классифицируют меченые иммунные клетки.
Переложите легкое в чашку Петри. Измельчите его с помощью двух тонких скальпелей, а затем поместите в 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте 5 миллилитров буфера для пищеварения, чтобы промыть тарелку. Закройте крышку трубки и переваривайте легкое в течение 30 минут на орбитальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту при температуре 37 градусов Цельсия. Остановите реакцию, добавив 10 миллилитров холодного буфера БСА.
После разложения смешайте и растворите кусочки легких с помощью иглы 18-го калибра. Поместите фильтрующий фильтр 70 микрометров на новую 50-миллилитровую коническую трубку и переложите переваренную легочную смесь в фильтр.
Используйте резиновую сторону 10-миллилитрового поршня шприца, чтобы разбить оставшиеся кусочки легких на фильтре, и промойте его буфером BSA. Центрифугируйте одноклеточную суспензию при 350 г в течение 8 минут при 7 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 миллилитре буфера для лизиса ACK. Смешайте суспензию с помощью пипетки объемом 1 миллилитр, и выдержите ее в течение 90 секунд при комнатной температуре.
Добавьте в реакционную смесь 10 миллилитров холодного буфера БСА, и центрифугируйте ее при 350 г в течение 7 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в окрашивающем буфере, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Ресуспендируйте клетки в концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр для поверхностного окрашивания.
Перенесите 1 миллион клеток по 200 микролитров на лунку в 96-луночный планшет и центрифугируйте планшет при 350 г в течение 7 минут при 4 градусах Цельсия. Приготовьте блочный раствор проточной цитометрии путем разведения антитела к 16/32 в окрашивающем буфере.
Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах блочного раствора проточной цитометрии. Выдерживайте суспензию от 15 до 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия или на льду. Затем добавьте в пластину 150 микролитров буфера для окрашивания и центрифугируйте его при 350 г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия.
Приготовьте поверхностный раствор антитела, разбавив поверхностные антитела в окрашивающем буфере. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах поверхностного раствора антитела, и инкубируйте планшет при температуре 4 градуса Цельсия в темноте. Затем дважды промойте клетки с окрашивающим буфером.
Приготовьте буфер для фиксации и пермеабилизации, смешав три части разбавителя фиксации и пермеабилизации и одну часть буфера для окрашивания. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах заранее подготовленного буфера на лунку 96-луночного планшета и инкубируйте их в течение 20-25 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте.
Разбавьте пермеабилизационный буфер очищенной деионизированной водой, чтобы приготовить одноразовый пермеабилизационный буфер, и используйте его для промывания клеток. Приготовьте раствор внутриклеточного антитела, разбавив его 1 миллилитром буфера для пермеабилизации. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах разбавленного раствора внутриклеточного антитела на лунку 96-луночного планшета и инкубируйте в течение 40 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте.
Промойте клетки пермеабилизационным буфером, затем буфером для окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах красящего буфера. Получите минимум 1,5 миллиона клеток в образце на проточном цитометре.
Обзор
В данной статье подробно описан протокол выделения и анализа иммунных клеток из легочной ткани мыши с помощью проточной цитометрии. Метод включает в себя переваривание ткани, лизис клеток и окрашивание специфическими антителами для идентификации различных типов иммунных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Теоретические основы
- Понимание популяций иммунных клеток имеет решающее значение для изучения заболеваний легких.
- Проточная цитометрия позволяет проводить детальный анализ поверхностных и внутриклеточных маркеров.
- Мышиные модели часто используются для изучения заболеваний человека.
- Выделение единичных клеток из тканей является критическим этапом в иммунологических исследованиях.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения иммунных клеток из легочной ткани.
- Обеспечить возможность анализа популяций иммунных клеток с помощью проточной цитометрии.
- Углубить понимание иммунного ответа при патологиях легких.
Используемые методы
- Измельченную ткань легкого подвергают перевариванию в буфере для выделения одиночных клеток.
- Клетки обрабатывают лизирующим буфером для удаления эритроцитов.
- Для поверхностного и внутриклеточного окрашивания используют антитела, меченные флуорофорами.
- Для классификации и анализа меченных иммунных клеток применяется проточная цитометрия.
Основные результаты
- Успешное выделение различных типов иммунных клеток из легочной ткани мыши.
- Проточная цитометрия эффективно позволяет различать разные популяции иммунных клеток.
- Данный протокол позволяет детально охарактеризовать иммунный ответ.
- Высокая жизнеспособность выделенных клеток обеспечивает возможность их дальнейшего использования в экспериментах.
Выводы
- Описанный метод эффективен для выделения и анализа иммунных клеток легких.
- Данный подход может быть применен в различных исследованиях в области иммунологии легких.
- Будущие исследования могут опираться на данный протокол для изучения иммунных механизмов при заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики количественно профилировать популяции клеток врожденного и адаптивного иммунитета в легких мышей, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в программах по изучению иммунологии и респираторных заболеваний. Обеспечивая получение воспроизводимых одноклеточных суспензий, готовых к проточному цитометрическому анализу, этот метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей и служит основанием для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки терапевтических кандидатов, модулирующих иммунитет легких. Данный протокол представляет иммунофенотипирование как масштабируемый и многократно используемый инструмент в рабочих процессах поиска и трансляционных исследований.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения подмножеств иммунных клеток в ткани легкого.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет стандартизированной изоляции и фенотипирования моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, NK-клеток, нейтрофилов, эозинофилов, B- и T-лимфоцитов.
- Прогностическая ценность: обеспечивает получение количественных данных проточной цитометрии, которые позволяют выяснить степень активации сигнальных путей и иммунную модуляцию под воздействием исследуемых соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать валидированные суспензии из отдельных клеток, подходящие для последующей оптимизации панелей антител и титрования флуорофоров.
- Воспроизводимость: стандартизированные этапы переваривания, лизиса и окрашивания обеспечивают стабильный выход иммунных клеток в различных экспериментах.
- Масштабируемость: формат 96-луночного планшета позволяет параллельно обрабатывать несколько условий или временных точек в рамках скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинических исследований, позволяя проводить иммунный профилинг на моделях заболеваний легких у мышей.
- Сопоставление биомаркеров: облегчает корреляцию частоты иммунных клеток с функциональными показателями или гистопатологическими результатами.
- Продвижение с учетом рисков: данные иммунного профилирования поддерживают механистическую интерпретацию эффектов соединений и способствуют принятию решений по отбору проектов в портфеле.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, обеспечивая иммунологический контекст активности соединений в тканях легких.
- Фундаментальная биология: Облегчает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем идентификации присутствующих и активных популяций иммунных клеток в легких мышей.
- Скрининг: Обеспечивает получение клеток, готовых к анализу, с количественно определяемыми поверхностными и внутриклеточными маркерами для надежного скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение частоты появления иммунных клеток и состояний их активации в различных группах лечения.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты исследований in vitro с доклинической преемственностью посредством стандартизированного иммунофенотипирования.
- Корпоративное использование: Создает переносимый протокол изоляции иммунных клеток, применимый в нескольких проектах по иммунологии легких.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в иммунных ответах легких.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию благодаря четко определенным протоколам переваривания, лизиса и окрашивания антителами.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет предоставления данных о механизме действия, опосредованном иммунным ответом, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов с поправкой на риск на основе профилей иммунной модуляции в релевантных системах заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссоциации тканей, проточной цитометрии и разработки многоцветных панелей антител.
- Зависит от наличия проточных цитометров, способных детектировать несколько флуорофоров, и центрифуг для обработки клеток.
- Необходимо стандартизировать титры антител, буферы для окрашивания и стратегии гейтирования для всех пользователей и центров.
- Адаптация метода для других тканей или видов может потребовать оптимизации пищеварительных ферментов и условий лизиса.
- Практические ограничения включают вариабельность выхода иммунных клеток в зависимости от типа ткани и необходимость обработки свежих тканей для сохранения жизнеспособности клеток.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Изоляция Ламина Проприа моноядерных клеток из Курина толстой с использованием коллагеназа E
Похожие видео
0 Просмотры
Высокоразмерная проточная цитометрия для анализа иммунной функции рассеченных тканей имплантата
Похожие видео
0 Просмотры
Флуоресцентная гибридизация in situ для изучения сперматогенеза комара Anopheles
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение мышиные клетки легких Дендритные
Похожие видео
0 Просмотры
Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований
Похожие видео
0 Просмотры
Идентификация и подсчет иммунных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа методом проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации
Похожие видео
0 Просмотры
Расширенный визуализации легких самонаведения человека лимфоцитов в экспериментальной модели Vivo аллергические воспаления, основанный на свет лист микроскопия
Похожие видео
0 Просмотры
Характеристика иммунных клеток и провоспалительных медиаторов в легочной среде
Похожие видео
0 Просмотры
Проточный цитометрический анализ для идентификации врожденных и адаптивных иммунных клеток мышиных легких
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026