Метод in vitro для идентификации врожденных и адаптивных иммунных клеток, обитающих в легких мышей

Возьмите измельченную мышиную легочную ткань в буфере для пищеварения и инкубируйте при физиологической температуре.

Буферные ферменты разрушают тканевый матрикс, разрыхляя клетки.

Растирайте для диссоциации клеточной массы и фильтруйте суспензию с помощью ситечка для изоляции отдельных клеток.

Центрифуга для удаления надосадочной жидкости с остатками тканей. Инкубируйте клетки с буфером для лизиса, чтобы лизировать эритроциты.

Центрифуга для удаления надосадочной жидкости, содержащей клеточный мусор. Ресуспензируйте клетки и перенесите их на микропланшет.

Добавьте антитела для блокировки Fc-рецепторов, предотвращая фоновое окрашивание.

Введение меченого флуорофорами коктейля антител, нацеленного на специфические поверхностные маркеры на клетках врожденного иммунитета — моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, естественных киллерах, нейтрофилах, эозинофилах и адаптивных иммунных клетках — В- и Т-лимфоцитах.

Фиксируют и проникают в клетки. Добавьте меченные флуорофорами антитела, специфичные к внутриклеточному маркеру на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и эозинофилах.

С помощью проточной цитометрии классифицируют меченые иммунные клетки.

Переложите легкое в чашку Петри. Измельчите его с помощью двух тонких скальпелей, а затем поместите в 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте 5 миллилитров буфера для пищеварения, чтобы промыть тарелку. Закройте крышку трубки и переваривайте легкое в течение 30 минут на орбитальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту при температуре 37 градусов Цельсия. Остановите реакцию, добавив 10 миллилитров холодного буфера БСА.

После разложения смешайте и растворите кусочки легких с помощью иглы 18-го калибра. Поместите фильтрующий фильтр 70 микрометров на новую 50-миллилитровую коническую трубку и переложите переваренную легочную смесь в фильтр.

Используйте резиновую сторону 10-миллилитрового поршня шприца, чтобы разбить оставшиеся кусочки легких на фильтре, и промойте его буфером BSA. Центрифугируйте одноклеточную суспензию при 350 г в течение 8 минут при 7 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 миллилитре буфера для лизиса ACK. Смешайте суспензию с помощью пипетки объемом 1 миллилитр, и выдержите ее в течение 90 секунд при комнатной температуре.

Добавьте в реакционную смесь 10 миллилитров холодного буфера БСА, и центрифугируйте ее при 350 г в течение 7 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в окрашивающем буфере, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Ресуспендируйте клетки в концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр для поверхностного окрашивания.

Перенесите 1 миллион клеток по 200 микролитров на лунку в 96-луночный планшет и центрифугируйте планшет при 350 г в течение 7 минут при 4 градусах Цельсия. Приготовьте блочный раствор проточной цитометрии путем разведения антитела к 16/32 в окрашивающем буфере.

Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах блочного раствора проточной цитометрии. Выдерживайте суспензию от 15 до 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия или на льду. Затем добавьте в пластину 150 микролитров буфера для окрашивания и центрифугируйте его при 350 г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Приготовьте поверхностный раствор антитела, разбавив поверхностные антитела в окрашивающем буфере. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах поверхностного раствора антитела, и инкубируйте планшет при температуре 4 градуса Цельсия в темноте. Затем дважды промойте клетки с окрашивающим буфером.

Приготовьте буфер для фиксации и пермеабилизации, смешав три части разбавителя фиксации и пермеабилизации и одну часть буфера для окрашивания. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах заранее подготовленного буфера на лунку 96-луночного планшета и инкубируйте их в течение 20-25 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте.

Разбавьте пермеабилизационный буфер очищенной деионизированной водой, чтобы приготовить одноразовый пермеабилизационный буфер, и используйте его для промывания клеток. Приготовьте раствор внутриклеточного антитела, разбавив его 1 миллилитром буфера для пермеабилизации. Ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах разбавленного раствора внутриклеточного антитела на лунку 96-луночного планшета и инкубируйте в течение 40 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте.

Промойте клетки пермеабилизационным буфером, затем буфером для окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах красящего буфера. Получите минимум 1,5 миллиона клеток в образце на проточном цитометре.