Процедура STAGE Tip для обессоливания и очистки пептидов

Возьмите STop And Go Extraction или STAGE Tip, миниатюрную очистительную колонку.

Наконечник содержит мелкие гранулы диоксида кремния, связанные с длинными цепочками углеводородов для очистки пептидов на основе гидрофобного взаимодействия.

Промыть буферами, содержащими высокий процент ацетонитрила, удаляя смоляные загрязнения.

Введите связующий буфер и центрифугу, уравновешивая колонку для оптимального связывания пептидов.

Загрузите предварительно переваренный образец пептида, полученный из дифференцированных нейтрофильных клеток, содержащих пептидные фрагменты и примеси, в том числе соли.

Центрифуга пропускает пробу через колонну. Пептидные фрагменты связываются с углеводородными цепями посредством гидрофобных взаимодействий, в то время как соли удаляются.

Добавьте связующий буфер и центрифугу, удалив оставшиеся примеси.

Введите буфер с высоким содержанием ацетонитрила для элюирования.

С помощью шприца пропустите буфер через колонку. Ацетонитрил связывается с углеводородными цепями, вытесняя пептидные фрагменты, которые вымываются вместе с буфером.

Протеомное профилирование для идентификации очищенных пептидов.

Для начала упакуйте три слоя смолы C18 в наконечник для пипетки объемом 200 микролитров, чтобы создать наконечник STop And Go Extraction или STAGE для каждого образца пептида.

Остановить ферментативное расщепление ранее инкубированных образцов пептидов путем добавления 1 на 10 объемов останавливающего раствора. Центрифугируйте образцы при 13 200 об/мин в течение 10 минут и перенесите надосадочную жидкость в новую 2-миллилитровую пробирку.

Затем промойте наконечники STAGE 100 микролитрами 100-процентного ацетонитрила и центрифугируйте наконечники STAGE при плотности 1000 г в течение 2 минут или пока вся жидкость не пройдет через смолу C18.

Повторите промывку наконечника STAGE с 50 микролитрами буфера B, а затем 200 микролитрами буфера A с теми же условиями центрифугирования.

Загрузите образцы в наконечники STAGE для центрифугирования при 1000 г в течение 3-5 минут. Затем промойте наконечники STAGE 200 микролитрами буфера А путем центрифугирования при 1000 г в течение 3-5 минут.

Затем добавьте 50 микролитров буфера B в каждый наконечник STAGE и с помощью шприца разбавьте образцы, содержащие буфер B, в 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку.

После того, как образцы будут вымыты, высушите пептиды с помощью вакуумной центрифуги в течение 45 минут. Прогоните образцы на масс-спектрометрии высокого разрешения в условиях, описанных в рукописи текста.

Для обработки данных для протеомного профилирования необходимо загрузить файлы исходных данных, полученных в результате масс-спектрометрии, в программное обеспечение MaxQuant. Обратитесь к текстовой рукописи за всеми параметрами программного обеспечения и его настройками.

В глобальных параметрах импортируем файл FASTA Homo sapiens для идентификации последовательностей, загруженный из базы данных Uniprot, записывая идентификатор организма, количество белков и дату загрузки файла.

Задайте количество ядер компьютера для обработки и нажмите кнопку Пуск. По завершении работы MaxQuant генерируется папка «Combined» вместе с другими файлами, необходимыми для загрузки в репозитории данных.

Чтобы проанализировать данные, загрузите «proteingroups.txt» в Perseus и выберите все файлы количественной оценки или интенсивности LFQ без меток в окне «Основной». Отфильтруйте строки, удалив загрязняющие вещества, обратные пептиды и пептиды, идентифицированные только по участку, и преобразуйте данные по log₂(x).

Чтобы наблюдать за количеством белков, обнаруженных в каждой реплике, постройте числовую диаграмму Венна и установите категориальные аннотации для каждого образца, указав одно и то же имя для всех реплик одного биологического образца.

Отфильтруйте строки на основе допустимого значения с белком, идентифицированным более чем в 50 процентах репликат и по крайней мере в одной группе. Чтобы заменить отсутствующие значения для LFQ, выполните импутацию из обычного распределения.

Добавьте информацию об аннотациях, загруженную с веб-сайта Perseus, в строки белков, добавив txt.gz файлы FASTA в папки 'bin', 'conf' и 'annotation'. Добавьте конкретные термины, такие как названия белков, названия генов и онтология генов.

Теперь матрица завершена и может быть визуализирована с помощью таких инструментов, как графики анализа главных компонент, тепловые карты и обогащение категорий. Проведите статистическое тестирование для определения значительных изменений в содержании белка между тестируемыми условиями.