Оценка функциональных нейтрализующих антител к SARS-CoV-2

Начните с серийно разбавленной сыворотки крови человека, содержащей различные концентрации нейтрализующих антител против коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 или SARS-CoV-2.

Введение псевдотипированных вирусов с люциферазной РНК, интегразой и обратной транскриптазой, инкапсулированных в липидный бислой, содержащий шиповидные белки SARS-CoV-2.

Антитела нейтрализуют вирусы на основе разведения сыворотки крови, при этом более низкие разведения демонстрируют максимальную нейтрализацию.

Введите клетки-мишени, экспрессирующие рецепторы ангиотензинпревращающего фермента-2 или рецепторы ACE2 и трансмембранную протеазу серин-2 или TMPRSS2.

При более высоких разведениях сыворотки ненейтрализованные вирусы взаимодействуют с рецепторами ACE2, в то время как TMPRSS2 расщепляет спайковый белок, обеспечивая слияние вирусов.

При поступлении РНК люциферазы обратно транскрибируется в ДНК, которая интегрируется в геном хозяина и продуцирует фермент люциферазу.

Замените среду буфером для анализа, содержащим субстрат люциферазы и лизирующий агент.

Клетки лизируются, высвобождая внутриклеточную люциферазу, которая взаимодействует с субстратом и производит высокую люминесценцию.

Количественно оцените люминесценцию в разведениях сыворотки для определения процента нейтрализации вируса — разведение, достигающее пятидесятипроцентной нейтрализации, представляет собой титр нейтрализации.

Для начала добавьте 50 микролитров DMEM с 10 процентами FBS и 1 процентом пенициллин-стрептомицина в ряды от B до H, столбцы с 1 по 12 белого 96-луночного планшета.

Добавьте 5 микролитров сыворотки выздоравливающих в лунки ряда А, столбцы со 2 по 10, в общем объеме 100 микролитров DMEM с 10 процентами FBS и 1 процентом пенициллин-стрептомицина. Добавьте по 5 микролитров положительных и отрицательных антисывороток в лунки А11 и А12 в качестве контроля.

Удалите 50 микролитров раствора из лунок ряда А и выполните двукратное серийное разведение всех лунок под ним. Для каждого разведения используйте многоканальную пипетку, чтобы перемешать растворы 5-10 раз, пипетируя вверх и вниз без образования пузырьков воздуха.

После завершения серийного разбавления сбросить последние 50 микролитров из последней лунки каждой колонны.

Центрифугируйте планшет в течение 1 минуты со скоростью 500 оборотов в минуту, чтобы убедиться, что на стенках лунки не осталось жидкости. Рассчитайте количество DMEM, необходимое для разбавления SARS-CoV-2 PV, как описано в текстовой рукописи.

Смешайте разбавленный раствор фотоэлектрического фильтра в тазу для дозатора и внесите 50 микролитров в каждую лунку, за исключением лунок от А6 до А12, которые содержат контрольную ячейку. Скважины от А1 до А6 служат только для управления фотоэлектрическими установками.

Центрифугируйте планшет в течение 1 минуты со скоростью 500 оборотов в минуту, чтобы убедиться, что на стенках лунки не осталось вируса. Затем инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия с 5-процентным содержанием углекислого газа в течение 1 часа, чтобы сыворотка могла соединиться с гликопротеином SARS-CoV-2.

Затем приготовьте планшет из клеток-мишеней HEK 293T/17, трансфицированных за 24 часа до этого плазмидами ACE2 и TMPRSS2. Извлеките питательную среду из тарелки и дважды промойте ее 2 миллилитрами PBS, добавив его на одну сторону чашки, чтобы избежать отслоения клеток.

Откажитесь от PBS и добавьте в тарелку 2 миллилитра трипсина. Поместите тарелку в инкубатор до тех пор, пока ячейки не отделятся.

После того, как клетки отделятся, добавьте в пластину 6 миллилитров DMEM с 10 процентами FBS и 1 процентом пенициллин-стрептомицина, чтобы погасить активность трипсина, и мягко ресуспендируйте клетки.

Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек или путем подсчета предметного стекла камеры. Добавьте 1 x 10 4 ячейки в общем объеме 50 микролитров в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5-процентным содержанием углекислого газа в течение 48-72 часов.

После инкубации удалите питательные среды из всех лунок и добавьте 25 микролитров смеси PBS и коммерческого реагента для анализа люциферазы в соотношении 1:1. Считывание показаний с помощью коммерческой системы анализа люциферазы с микропланшетным люминометром.

Используя исходные данные, полученные люминометром, рассчитать титры нейтрализующих антител IC50, как описано в рукописи текста.