Измерение уровня иммуноглобулина G в сравнении с тестируемой вакциной в сыворотке крови мышей

Начните с многолуночного планшета, покрытого тестовой вакциной, и заблокируйте неспецифические участки взаимодействия.

Возьмите образец сыворотки крови у мыши, которой была введена исследуемая вакцина.

Эта сыворотка содержит иммуноглобулин G, или IgG, антитела, которые распознают исследуемую вакцину.

В лунки, покрытые вакциной, добавить последовательно разведенные образцы сыворотки.

IgG связываются с вакциной. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Добавьте пероксидазу-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с IgG. Удалите несвязанные вторичные антитела.

Добавьте хромогенный субстрат. Пероксидаза взаимодействует с субстратом, образуя продукт синего цвета.

Введите кислоту, чтобы остановить реакцию. Изменение pH окрашивает раствор в желтый цвет.

С помощью спектрофотометра измерьте интенсивность цвета каждой лунки, чтобы определить концентрацию IgG в образце сыворотки крови.

Для покрытия антигеном иммуноферментного анализа, или планшета для ИФА, разбавьте антиген белка HI до 10 мкг на миллилитр раствором для покрытия и добавьте 100 мк разведенного антигена на лунку в планшете для ИФА. Инкубируйте тарелку при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. После инкубации вымойте тарелку с 300 микролитрами PBST на лунку.

Запечатайте лунки 300 микролитрами герметизирующего раствора на лунку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем разбавьте три микролитра сыворотки мышей из каждой экспериментальной группы в 100 раз, добавив 297 микролитров PBST, и сделайте разбавленную сыворотку вихрем. Добавьте 100 микролитров разведенной сыворотки на лунку в пластину с покрытием для ИФА для каждого образца сыворотки. Аналогичным образом, разбавьте положительные и отрицательные контрольные сыворотки в 100 раз PBST, добавив 4 микролитра положительной или отрицательной контрольной сыворотки к 396 микролитрам PBST с последующим вихревым перемешиванием.

Для выполнения разведения в двойном соотношении добавьте 200 микролитров ранее разведенной экспериментальной сыворотки в первый ряд покрытой пластины ИФА. Затем добавьте 100 микролитров PBST во все лунки, кроме тех, которые находятся в первом и 12 рядах. Далее отрегулируйте дозатор на 100 микролитров и переведите 100 микролитров сыворотки из первого ряда во второй ряд, содержащий PBST.

Перемешайте содержимое во втором ряду 10 раз, используя пистолет-пипетку. Аналогично выполните последовательное разведение сыворотки в соотношении 1:2 до строки 11. Как только это будет сделано, слейте 100 микролитров жидкости из 11 ряда.

Добавьте по 100 микролитров разведенной отрицательной и положительной сыворотки в каждую соответствующую лунку в строке 12, следуя шаблону образца. Закройте планшет ИФА полиэтиленовой пленкой и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Между тем, разбавьте вторичные антитела против мышиного IgG HRP в 10 000 раз, добавив PBST. После часовой инкубации промойте планшет ИФА 300 микролитрами PBST на лунку, чтобы очистить несвязанные антитела. Затем добавьте по 100 микролитров разведенного вторичного антитела в каждую лунку, и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут.

Вымойте тарелку 300 микролитрами PBST на лунку. Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора для проявки цвета TMB. Поместите тарелки при температуре 37 градусов Цельсия и подальше от света на 10 минут. После чего немедленно прекратить реакцию 50 микролитрами 2 моляров серной кислоты. Определите значения оптической плотности или OD на 450 нанометрах с помощью ферментного маркера в течение 15 минут после терминации.