Оценка каспазо-опосредованного расщепления вирусных белков и белков хозяина в инфицированных вирусом клетках

Начните с инфицированных вирусом клеток млекопитающих, которые продуцируют множественные каспазы, включая каспазу-3.

Добавьте питательную среду в контрольную лунку и среду с добавлением ингибитора каспазы-3 в тестовую лунку.

В контрольной лунке каспазы-3 распознают и разрушают вирусные нуклеопротеины и белки хозяина, необходимые для размножения вируса.

В испытательной лунке ингибитор проникает в клетку, подавляя активность каспазы-3 и препятствуя деградации белка.

Выбиваем ячейки из пластины. Добавьте лизирующий реагент и нагрейте, чтобы вызвать лизис клеток, высвобождая внутриклеточные белки.

Загрузите оба образца в SDS-полиакриламидный гель и электрофорез, чтобы разделить белки в зависимости от размера.

После электрофореза перенесите гель на промокательную пленку.

Обработайте мембрану первичными антителами против вирусных нуклеопротеинов и белков хозяина.

Промойте и наложите флуорконъюгированные вторичные антитела, связывающиеся с первичными антителами, образуя флуоресцентные полосы.

Более высокая флуоресценция в испытуемом образце указывает на снижение расщепления вируса и белка хозяина, опосредованного каспазой-3, по сравнению с контролем.

Для начала посейте клетки MDCK или A549 в 12-луночный планшет для культивирования клеток, инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. На следующий день удалите старую питательную среду из клеток и дважды промойте клетки в каждой лунке 1 миллилитром МЭМ, не содержащего сыворотки.

Затем заразите клетки, добавив 400 микролитров инокулюма вируса гриппа А и поместите тарелку для инкубации на один час. После инкубации удалите вирусный посев и промойте клетки MEM. Добавьте 1 миллилитр МЭМ, не содержащего сыворотки, в каждую лунку и инкубируйте клетки, как показано на предыдущем этапе.

Через 24 часа соберите клетки, соскоблив их с помощью поршня шприца объемом 1 миллилитров, и переложите их в 1,5-миллилитровую трубку. Центрифугируйте пробирку при 12 000 г в течение двух минут при комнатной температуре и соберите надосадочную жидкость. Промойте клеточную гранулу 250 микролитрами фосфатно-солевого буфера и центрифугой. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 100 микролитров буфера для лизиса клеток. Перемешиваем по вихрю.

Нагрейте трубку до 98 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы полностью лизировать клетки. Затем разрешите равное количество белка из неинфицированных и инфицированных образцов с помощью стандартного электрофореза в полиакриламидном геле SDS. После электрофореза перенесите белковый гель на мембрану из нитроцеллюлозы или ПВДФ и выполните вестерн-блоттинг. Сравните уровни белка в инфицированных образцах, обработанных имитацией и ингибиторами.