Анализ для измерения накопления флуоресцентного зонда антибиотика в бактериальных клетках

Возьмите пробирки, содержащие образцы бактерий.

В испытуемый образец добавьте молекулы ингибитора, чтобы блокировать насос оттока антибиотиков бактерий.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте флуорофор-конъюгированные зонды антибиотиков, которые проникают в бактериальные клетки.

В контрольном образце отточный насос выдавливает зонды во внеклеточную среду.

В образце, обработанном ингибитором, заблокированный насос оттока не может вытеснить зонды, что приводит к их накоплению.

Центрифугируйте образцы. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую внеклеточные зонды.

Добавьте буфер для лизиса с последующим лизоцимом, чтобы ослабить клеточную стенку бактерии.

Выполнение циклов замораживания-оттаивания, ультразвуковой обработки и высокотемпературного воздействия для лизиса клеток.

центрифуга. Перенесите надосадочную жидкость на фильтрующую мембрану.

Промойте и соберите фильтрат, содержащий зонды.

Измерьте интенсивность флуоресценции фильтрата.

Более высокая интенсивность флуоресценции в образцах бактерий, обработанных ингибиторами, свидетельствует о потере функции оттока, что приводит к накоплению внутриклеточного зонда.

Для анализа накопления зонда нанесите запасы глицерина бактериальных штаммов на агаровые планшеты LB для ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро выберите одну колонию с тарелки для ночного выращивания в бульоне лизогенеза при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующее утро разведите ночную культуру примерно в 50 раз в свежей среде.

Когда культура достигнет середины логарифмической фазы, гранулируйте бактерии центрифугированием и сцедите среду. Повторно суспендируйте бактерии в 1 миллилитре PBS и снова центрифугируйте бактерии. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте промытую гранулу в PBS до оптической плотности на 600 нанометров от двух.

Добавьте 10,1 микролитра 10 миллимолярного CCCP в PBS к 1 миллилитру бактерий и инкубируйте бактерии при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. В конце инкубации соберите бактерии центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре 10-100 микромольного флуоресцентного раствора антибиотика в PBS.

После 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия четыре раза промойте клетки центрифугированием в 1 миллилитре холодной PBS на одну промывку. После промывки лизизируйте бактерии 180 микролитрами лизисисного буфера и 70 микролитрами лизоцима.

Через 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия трижды заморозьте-разморозьте бактерии при температуре минус 78 градусов Цельсия в течение 5 минут и при температуре 34 градуса Цельсия в течение 15 минут соответственно. После последнего раунда замораживания-размораживания образец облучайте ультразвуком в течение 20 минут, после чего следует 30-минутная инкубация при температуре 65 градусов Цельсия.

В конце инкубации соберите лизированный образец центрифугированием и процедите содержимое пробирки через фильтрующую мембрану с температурой 10 килодальтон. Промойте фильтр четыре раза 100 микролитрами воды на одну промывку и распределите каждую промывку в отдельные лунки черной 96-луночной пластины с плоским дном. Затем измерьте интенсивность флуоресценции на планшетном считывателе с длинами волн возбуждения и излучения, соответствующими флуорофору.