Выделение инвариантных естественных киллеров Т-клеток из мышиной модели
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 3:35 мин • July 8th, 2025
Начните с внутрибрюшинного введения синтетического гликолипида мыши.
Антигенпрезентирующие клетки, или APC, интернализуют гликолипид и представляют его через неклассическую молекулу MHC CD1d.
АПК мигрируют в селезенку и взаимодействуют с инвариантными естественными киллерами Т-клетками или клетками iNKT, индуцируя активацию и пролиферацию клеток iNKT.
Соберите урожай из селезенки. Механически диссоциируйте его, чтобы получить одноклеточную суспензию.
Переложите клетки в пробирку. Добавьте градиент плотности среды и центрифугуйте для разделения лимфоцитов.
Соберите лимфоциты. Добавьте гликолипидные антигены, меченные флуорофорами CD1d-тетрамеры, которые взаимодействуют с клетками iNKT.
Удалите несвязанные тетрамеры. Наложение магнитных микрошариков, которые связываются с тетрамер-связанными флуорофорами.
Удалите несвязанные шарики и загрузите суспензию элемента на магнитную колонку.
Под действием магнитного поля связанные с шариками элементы iNKT удерживаются в колонке, в то время как остальные ячейки протекают через нее.
Извлеките колонку из магнитного поля. Добавьте элюирующий буфер для элюирования ячеек iNKT.
Внутрибрюшинно вводите нормальному DBA/1 мыши альфа-GalCer в дозе 0,1 мг на килограмм массы тела. Через три дня после моделирования, после обезболивания, изолируйте селезенку мыши. Приготовьте одноклеточную суспензию, разрезав и измельчив селезенку в сите с 200 мешами. Промойте клеточную суспензию с помощью PBS. Центрифугируйте при 200 умноженных на g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
Суспендируйте клетки с помощью 1 миллилитра цельной крови и раствора для разведения тканей. Добавьте 3 миллилитра среды для разделения лимфоцитов мыши, а затем центрифугируйте клетки в течение 20 минут, при 300-кратном изгне, при комнатной температуре.
Чтобы очистить клетки iNKT, ресуспендируйте от 10 до 7 клеток 100 микролитрами 4 градусов Цельсия PBS. Добавьте 10 микролитров CD1d Tetramer-PE, загруженного альфа-GalCer, и инкубируйте их при температуре 4 градуса Цельсия в течение 15 минут в темноте. Дважды промойте клетки PBS, и повторно суспендируйте их в 80 микролитрах PBS. Добавьте 20 микролитров микрогранул анти-ПЭ и инкубируйте их при температуре 4 градуса Цельсия в течение 20 минут в темноте. Дважды промойте их PBS и повторно суспензируйте клетки 500 микролитрами PBS.
Поместите сортировочную колонну в магнитное поле сортировщика MACS, и промойте 500 микролитрами PBS. Добавьте подготовленную суспензию клеток в сортировочную колонну, соберите проточную жидкость и трижды промойте буфером PBS. Снимите магнитное поле и добавьте в сортировочную колонку 1 миллилитр буфера PBS. Быстро нажмите на поршень с постоянным давлением, чтобы ввести меченые элементы в сборную трубку и получить очищенные элементы iNKT. Подсчет с помощью автоматического счетчика ячеек.
Обзор
В данной статье описывается метод выделения инвариантных естественных киллеров Т-клеток (iNKT-клеток) из ткани селезенки мыши. Процесс включает использование синтетического гликолипида и специальных методов маркировки для очистки iNKT-клеток с целью их дальнейшего исследования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Нейронаука
Теоретические сведения
- Инвариантные естественные киллеры Т-клеток (iNKT-клетки) играют ключевую роль в иммунных ответах.
- Понимание механизмов активации iNKT-клеток позволяет получить представление о регуляции иммунитета.
- Изоляция iNKT-клеток необходима для изучения их функций и механизмов действия.
- Использование гликолипидов в качестве антигенов является распространенным методом активации iNKT-клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения iNKT-клеток из селезенки мыши.
- Облегчить изучение биологии iNKT-клеток и их роли в иммунных ответах.
- Предоставить протокол, который может быть воспроизведен в других исследовательских условиях.
Используемые методы
- Внутрибрюшинное введение синтетического гликолипида мышам.
- Выделение селезенки и получение суспензии одиночных клеток.
- Использование центрифугирования в градиенте плотности для разделения лимфоцитов.
- Применение тетрамеров CD1d и магнитной сортировки для очистки iNKT-клеток.
Основные результаты
- Успешное выделение iNKT-клеток с использованием описанного протокола.
- Достижение высокой чистоты iNKT-клеток посредством магнитной сепарации.
- Демонстрация эффективности гликолипидных антигенов в активации iNKT-клеток.
- Протокол может быть адаптирован под различные экспериментальные задачи.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к выделению iNKT-клеток.
- Полученные данные могут углубить понимание иммунных механизмов.
- Будущие исследования могут опираться на этот протокол для изучения функций iNKT-клеток.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Надежное выделение инвариантных естественных киллеров T-клеток (iNKT-клеток) из мышиных моделей позволяет точно исследовать функции иммунных клеток и способствует механистическому снижению рисков в программах поиска новых лекарственных средств, ориентированных на иммунологию. Эта возможность имеет критическое значение для валидации мишеней и создания надежных доклинических моделей, которые служат основой для трансляционных исследований. Препараты iNKT-клеток высокой чистоты обеспечивают воспроизводимость последующих анализов, повышая прогностическую уверенность в стратегиях иммуномодуляции.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверять иммунологические гипотезы, связанные с активацией и функцией iNKT-клеток.
- Способствует механистическому снижению рисков путем изоляции популяций клеток для исследования сигнальных путей.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней в иммунных контекстах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных высокочистых iNKT-клеток для разработки анализов и скрининга соединений.
- Повышает воспроизводимость и количественные показатели в анализах на основе иммунных клеток.
- Позволяет масштабировать подготовку валидированных клеточных популяций для повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Поддерживает разработку доклинических моделей для исследований иммуномодуляции.
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров, обеспечивая получение функциональных данных из изолированных iNKT-клеток.
- Снижает биологическую неопределенность в терапевтических программах, направленных на иммунную систему.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол выделения iNKT-клеток применим на этапах от раннего поиска до доклинических исследований, поддерживая как поиск гипотез, так и разработку анализов для программ иммуномодуляции.
- Открывающая биология: обеспечивает выделение и функциональное тестирование iNKT-клеток для валидации путей и мишеней.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные клеточных анализов для оценки соединений.
- Аналитика: дает измеримые результаты, такие как количество и чистота клеток, для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает стадию открытия и доклинические исследования путем предоставления популяций иммунных клеток, релевантных конкретным заболеваниям.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый для различных программ исследований иммунных клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность при валидации иммунных мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую и масштабируемую изоляцию клеток для последующих этапов анализа.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала в портфелях, ориентированных на иммунологию.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию активов по иммуномодуляции с учетом рисков.
Особенности внедрения
- Требуется опыт в области иммунологии и методов изоляции клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии, магнитной сепарации и подсчета клеток.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод применим к различным моделям мышей, однако может потребоваться оптимизация протокола для разных линий.
- Результат зависит от доступности специфических реагентов, таких как гликолипидные антигены и меченые тетрамеры.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Интегрировать изображений проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование для оценки измененных Endocytic CD1d торговля
Похожие видео
0 Просмотры
Очистка и расширение мышечных инвариантных естественных Т-киллеров для исследований in vitro и in vivo
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение CD4 + Т-клеток от мышей лимфатических узлов с помощью Miltenyi MACS очистки
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение естественных клеток-киллеров из ткани печени для селективной экспансии
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение инфильтрирующих опухоль иммунных клеток из головного мозга мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Мышь наивного CD4
Похожие видео
0 Просмотры
Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение врожденных лимфоидных клеток матки для анализа методом проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026