Метод ex vivo для получения химерных антигенных рецепторов Т-клеток

Возьмите первичные Т-клетки, смешанные с магнитными шариками, сопряженными с антителами, в среде, дополненной интерлейкином-2, и инкубируйте.

Антитела связываются с CD3 в комплексе Т-клеточных рецепторов и костимулирующем рецепторе CD28, в то время как интерлейкин-2 связывается со своим родственным рецептором, вызывая активацию и пролиферацию Т-клеток.

Введите лентивирусные векторы с трансгенной РНК, кодирующей химерный антигенный рецептор или CAR, и инкубируйте.

При слиянии мембран вектора и клетки вирусная РНК претерпевает обратную транскрипцию в ДНК, интегрируясь в геном хозяина.

Трансдуцированные Т-клетки экспрессируют поверхностно-связанные CAR.

Собирайте клетки через определенные промежутки времени.

Для криоконсервации берут аликвоту клеток, отделяют связанные шарики пипетированием и отделяют их магнитом.

Раскрутите клетки и снова суспендируйте их в криоконсервирующей среде.

Заморозьте клетки и храните их при криогенной температуре.

Чтобы оценить экспрессию CAR, возьмите еще одну аликвоту клеток, раскрутите клетки вниз и снова суспендируйте их в буфере.

Введите специфичное для CAR антитело, помеченное флуоресцентной меткой, и определите экспрессию CAR с помощью проточной цито