Основанное на миРНК ингибирование аутофагии в незрелых дендритных клетках, инфицированных вирусом простого герпеса

Возьмите две кюветы для электропорации. Одна кювета содержит небольшую интерферирующую РНК, или миРНК, предназначенную для ингибирования производства FIP200, белка, индуцирующего аутофагию.

Вторая кювета содержит скремблированную миРНК в качестве контроля, которая не ингибирует продукцию FIP200.

Добавьте незрелые дендритные клетки, или iDCs, электропорируйте для клеточного проникновения миРНК, а затем наложите пластины на клетки.

Интернализованная миРНК связывается с РНК-индуцирующим сайленсинговым комплексом.

Комплекс со специфичной для FIP200 миРНК расщепляет свою мишенную мРНК, ингибируя продукцию FIP200, в то время как контрольные iDC, обработанные миРНК, продуцируют FIP200.

Соберите клетки и добавьте вирус простого герпеса. При слиянии мембраны вирусной оболочки и клетки высвобожденная ДНК попадает в ядро и приводит к образованию вирусных белков и нуклеокапсидов.

Вирусные белки разрушают ядерные ламины. FIP200 образует комплекс, который запускает сигнальный каскад, индуцируя аутофагию разрушенных ламинов для их деградации и способствуя выходу вирусных нуклеокапсидов в цитоплазму.

МиРНК-опосредованное ингибирование продукции FIP200 ограничивает аутофагию ламина, предотвращая ускользание нуклеокапсидов.

Клетки готовы к оценке индуцированного миРНК ингибирования аутофагии.

На 3,5 день после прилипания перенесите 12 миллионов iDCs в 50-миллилитровую трубку. Центрифугируйте их при 300 умноженных на г в течение 5 минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Параллельно выполняйте проточный цитометрический анализ для контроля состояния созревания.

Аккуратно промойте iDC в 5 миллилитрах OptiMEM без фенолового красного, и центрифугируйте их при 300 г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах OptiMEM, регулируя концентрацию клеток до 6 миллионов клеток на 100 микролитров.

Добавьте 75 пикамолей либо FIP200-специфичной, либо скремблированной миРНК в кюветы с 4-миллиметровыми электродами и перенесите 100 микролитров клеточной суспензии в соответствующую кювету. Прямое импульсное воздействие на iDC с помощью аппарата электропорации.

После электропорации переложите iDC в шестилуночные планшеты со свежей предварительно подогретой средой DC, засев клетки в конечной концентрации 1 миллион клеток на миллилитр, и поместите их в инкубатор. Через 48 часов исследуйте морфологию электропорированных iDCs под микроскопом, затем соберите клетки с помощью скребка для клеток и перенесите их в 15-миллилитровые пробирки.

Промойте лунки 1 миллилитром PBS с добавлением 0,01% ЭДТА и переведите раствор в соответствующие пробирки. Затем разделите клетки для каждого условия миРНК, как описано в рукописи.

Используйте 500 000 клеток для оценки статуса созревания и жизнеспособности клеток. Используйте 1 миллион клеток для вестерн-блоттинга, чтобы проверить эффективность 200 удельного нокдауна, а оставшиеся клетки используйте для экспериментов по инфекции ВПГ-1.