Метод ex vivo для получения опухолеспецифичных химерных антигенных рецепторов Т-клеток

Принимайте ретровирусные векторы, смешанные с первичными клетками селезенки.

Векторы содержат трансгенную РНК, кодирующую химерный антигенный рецептор или CAR, который нацелен на опухолеспецифический антиген.

Цитокин интерлейкин-2 в среде избирательно способствует пролиферации Т-клеток, в то время как другие клетки в конечном итоге умирают.

Переложите смесь на микропланшет, покрытый фрагментами рекомбинантного фибронектина.

Центрифуга для облегчения связывания фрагментов фибронектина с векторами и Т-клетками, опосредуя взаимодействие вируса с клеткой-хозяином, и инкубации.

После слияния оболочки векторов с клеточной мембраной вирусные ферменты обратное транскрибирование высвобожденной РНК в ДНК и встраивание ее в геном хозяина.

Трансдуцированные Т-клетки экспрессируют поверхностно связанные CAR, состоящие из вариабельного фрагмента внеклеточного антитела, нацеленного на опухолеспецифический антиген и внутриклеточные сигнальные области для ответа на антиген.

Повторно суспендируйте клетки перед тем, как перенести их в трубку.

Центрифуга отбрасывает надосадочную жидкость, содержащую неинтернализованные вирусы, и повторно суспендирует клетки в буфере для последующих анализов.

На следующий день после спленэктомии приготовьте PBS, содержащий 25 микрограммов на миллилитр рекомбинантного фрагмента фибронектина человека или RHFF, и покройте 24-луночные планшеты, не обработанные тканевой культурой, добавив по 0,5 миллилитра раствора в каждую лунку. На следующий день достаньте раствор из лунок, и добавьте 1 миллилитр на лунку 2% БСА в PBS.

Выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем удалите BSA, сильно перевернув пластину, прежде чем добавить 2 миллилитра PBS для мытья. Собрав вирусную надосадочную жидкость из HEK293T клеток, добавьте свежую ТКМ до конечного объема в миллилитрах, равного количеству лунок, покрытых RHFF, плюс дополнительные 3 миллилитра.

Извлеките культивированные спленоциты из инкубатора и восстановите суспендию, осторожно пипетируя вверх и вниз два-три раза в каждой лунке. Переложите клеточные суспензии в 50-миллилитровую коническую трубку. Далее ресуспендируют спленоциты в вирусной надосадочной жидкости до 1 х 10⁶ клеток на миллилитр.

Затем добавьте 1 миллилитр на лунку суспензии спленоцитов в лунки пластин, покрытых RHFF. Теперь вращайте пластины в течение 90 минут при температуре 32 градуса Цельсия и 770 gс ускорением 4 и нулевым значением разрыва. Во время отжима приготовьте 50 международных единиц на миллилитр рекомбинантного человеческого IL-2 в ТКМ.

После отжима добавьте по 1 миллилитру среды в каждую лунку пластин и выдерживайте в течение ночи. Если конфлюенция Т-клеток превышает 80%, разделите клетки путем осторожного пипетирования вверх и вниз в каждой лунке два-три раза, а затем перенесите 1 миллилитр из каждой лунки в новые лунки свежей 24-луночной тарелки, обработанной культурой тканей.

Добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру свежей ТКМ, с 50 международными единицами на миллилитр IL-2. Если конфлюенция клеток не превышает 80%, замените половину среды, медленно отпиливая 1 миллилитр среды с верхней части каждой лунки и заменяя ее 1 миллилитром свежей ТКМП, содержащей 50 международных единиц на миллилитр рекомбинантного человеческого IL-2.

Ресуспендируйте CAR-Т-клетки путем осторожного пипетирования вверх и вниз три раза в каждой лунке, и переложите в центрифужную пробирку объемом 250 миллилитров. Вращайте ячейки при 300 gs в течение 10 минут. Далее полностью отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Используйте PBS для промывки клеток, затем посчитайте их перед второй промывкой. Типичный выход CAR-Т-клеток составляет примерно 1 x 10-6 клеток на лунку.