Генетическая модификация CAR-Т-клеток с помощью системы CRISPR-Cas9

Начните с суспензии Т-клеток и обработайте их лентивирусами CAR, несущими ген рецептора химерного антигена или лентивирусами CAR и CRISPR.

Лентивирус CRISPR содержит гены направляющей РНК и нуклеазы Cas9, а также ген устойчивости к антибиотикам.

Лентивирусы CAR и CRISPR взаимодействуют с Т-клетками и высвобождают их РНК.

Эти РНК перезаписываются и преобразуются в соответствующую ДНК, которая интегрируется в ДНК Т-клеток.

Это позволяет синтезировать белки CAR, направляющие РНК и белки Cas9.

Направляющая РНК образует комплекс с Cas9, который специфически распознает и связывается с геном-мишенью на ДНК Т-клетки.

Тем временем Cas9 расщепляет ДНК, создавая двухцепочечный разрыв.

Этот разрыв восстанавливается с помощью негомологичного соединения концов, подверженного ошибкам механизма репарации, что приводит к модификации гена-мишени.

При этом генерируются генетически модифицированные Т-клетки с химерными антигенными рецепторами.

Обрабатывайте клетки антибиотиками для уничтожения немодифицированных Т-клеток и селективно выделяйте генетически модифицированные CAR-Т-клетки.

Чтобы разрушить гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, используйте направляющую РНК, как описано