Генетическая модификация CAR-Т-клеток с помощью системы CRISPR-Cas9

Начните с суспензии Т-клеток и обработайте их лентивирусами CAR, несущими ген рецептора химерного антигена или лентивирусами CAR и CRISPR.

Лентивирус CRISPR содержит гены направляющей РНК и нуклеазы Cas9, а также ген устойчивости к антибиотикам.

Лентивирусы CAR и CRISPR взаимодействуют с Т-клетками и высвобождают их РНК.

Эти РНК перезаписываются и преобразуются в соответствующую ДНК, которая интегрируется в ДНК Т-клеток.

Это позволяет синтезировать белки CAR, направляющие РНК и белки Cas9.

Направляющая РНК образует комплекс с Cas9, который специфически распознает и связывается с геном-мишенью на ДНК Т-клетки.

Тем временем Cas9 расщепляет ДНК, создавая двухцепочечный разрыв.

Этот разрыв восстанавливается с помощью негомологичного соединения концов, подверженного ошибкам механизма репарации, что приводит к модификации гена-мишени.

При этом генерируются генетически модифицированные Т-клетки с химерными антигенными рецепторами.

Обрабатывайте клетки антибиотиками для уничтожения немодифицированных Т-клеток и селективно выделяйте генетически модифицированные CAR-Т-клетки.

Чтобы разрушить гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, используйте направляющую РНК, как описано в рукописи. Инкубировать реагенты для трансфекции при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации добавьте их к клеткам 293T, которые достигли от 70% до 90% конфлюенции, и культивируйте трансфицированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия, 5%_CO2 для получения лентивируса.

Через 24 и 48 часов соберите, и сконцентрируйте вируссодержащую надосадочную жидкость методом ультрацентрифугирования в 50-миллилитровых ультрацентрифужных пробирках, и заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования. Затем, в первый день, аккуратно ресуспендируйте Т-клетки, чтобы разбить розетки.

В лаборатории, одобренной BSL-2 plus, для получения CAR-Т-клеток добавьте к стимулированным Т-клеткам лентивирус CAR19 и лентивирус CRISPR, нацеленный на GM-CSF. На третий и пятый день для успешно трансдуцированных ленти-CRISPR Т-клеток, несущих резистентность к пуромицину, обрабатывайте клетки пуромицина дигидрохлоридом в концентрации 1 микрограмм пуромицина на миллилитр.