Метод CRISPR-Cas9 для редактирования генов в Т-клетках

Возьмем, к примеру, Т-клетки, взвешенные в среде, пригодной для электропорации, процесса, при котором электрические импульсы создают временные поры в клеточной мембране.

Добавьте комплексы, содержащие белок Cas9 и одну направляющую РНК или sgRNA. sgRNA — это маленькая РНК, которая направляет Cas9, молекулярные ножницы, в определенное место на ДНК для разрезания.

Добавьте короткие одноцепочечные молекулы ДНК, которые помогают транспортировать комплексы Cas9-sgRNA в клетку.

Переведите эту смесь в кювету и начните электропорацию путем подачи коротких электрических импульсов.

Этот процесс позволяет комплексам проникать в клетку.

sgRNA связывается с целевым участком в ДНК Т-клеток, позволяя Cas9 редактировать ДНК, создавая разрыв в обеих цепях.

Это нарушение сигнализирует о том, что белки репарации поступают на сайт.

Затем белки репарации воссоединяют концы, что делает ген нефункциональным.

Инкубируйте генетически отредактированные Т-клетки в подходящей среде для последующих анализов.

Приготовьте рибонуклеопротеин, или комплекс РНП, путем инкубации 10 мкг нуклеазы Cas9 с 5 мкг одной направляющей РНК в течение 10 минут при комнатной температуре. Включите макет контроля без одной направляющей РНК. Объедините ресуспендированные Т-клетки с комплексом РНП и добавьте 4,2 микролитра 4-микромолярного усилителя электропорации. Хорошо перемешайте, и переложите в кюветы для электропорации.

Гальваническое покрытие элементов с помощью импульсного кода EH-1-11. Затем инкубируйте 5 миллионов клеток на миллилитр в R-10 с добавлением пяти нанограммов на миллилитр человеческого IL-7 и человеческого IL-15 при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов в 12-луночных планшетах. После инкубации приступайте к активации и экспансии Т-клеток.