Создание модели мыши с двойным очеловечиванием BLT (костный мозг, печень, тимус)

Начните с мыши под наркозом с иммунодефицитом, у которой отсутствуют иммунные клетки.

Обработайте мышь сублетальной дозой рентгеновского излучения, чтобы удалить существующие стволовые клетки из костного мозга.

Препарируйте мышь и доставьте фрагменты печени плода человека и ткани тимуса между почкой и ее капсулой.

Закройте разрез.

Имплантированная ткань печени и тимуса разрастается, образуя органоиды, которые представляют собой клеточные агрегаты, напоминающие орган.

После выздоровления в хвостовую вену вводят человеческие гемопоэтические стволовые клетки или ГСК.

Введенные ГСК мигрируют в органоид тимуса и костный мозг, дифференцироваясь в различные иммунные клетки человека.

Обеспечьте мышь водой, обогащенной антибиотиками, чтобы убить существующие кишечные микробы.

Используя ротовую трубку, введите человеческие фекальные микробы непосредственно в кишечник мыши, чтобы способствовать микробной колонизации.

Это приводит к разработке двойной гуманизированной модели BLT-мыши с иммунной системой человека и кишечными микробами.

Чтобы имплантировать ткани печени и тимуса в капсулу левой почки, сначала поместите мышь в капюшон. В день операции обработайте мышей сублетальным облучением всего тела в дозе 12 сантигрей на грамм массы тела. Побрейте каждую мышь вокруг левой боковой и медиальной стороны после подтверждения соответствующего уровня седативного эффекта. Нанесите на глаза животного офтальмологическую мазь, при необходимости наклейте ушную бирку, а кожу продезинфицируйте тремя последовательными скрабами с йодом и 70% изопропанолом.

Когда кожа подготовлена, с помощью щипцов загрузите в троакар фрагмент ткани печени человеческого плода размером от 1 до 1,6 миллиметра в кубе, а затем один фрагмент ткани тимуса человеческого плода размером от 1 до 1,6 миллиметра. С помощью щипцов подтяните кожу, а с помощью скальпеля сделайте небольшой продольный надрез на коже. Удлините разрез на 1,5-2 сантиметра с левой стороны мыши и с помощью щипцов приподнимайте мышечный слой. С помощью ножниц раскройте мышечный слой в продольном направлении, расширяя разрез по мере необходимости, обнажите почку и аккуратно захватите жировую ткань, окружающую почку.

С помощью скальпеля сделайте разрез от 1 до 2 миллиметров на заднем конце капсулы почки и медленно введите предварительно загруженный троакар в разрез параллельно длинной оси почки. Освободите ткани между капсулой почки и почкой и верните почку и кишечник в нормальное положение. Затем используйте швы, чтобы закрыть мышечный слой, и хирургические скобы, чтобы закрыть кожу. Поместите мышь в автоклавную микроизоляционную клетку с контролем до полного лежачего положения. Через шесть часов после операции поместите мышей под нагревательную лампу и продезинфицируйте их 70% изопропанолом.

Введите от 1,5 до 5 x 10⁵ CD34-положительных выделенных гемопоэтических стволовых клеток ткани печени человеческого плода в 200 микролитрах PBS в одну расширенную хвостовую вену каждому животному. Затем остановите кровотечение с помощью легкого надавливания и верните мышей в их домашнюю клетку. Через 9-12 недель после операции используйте пластиковый конусный фиксатор соответствующего размера, чтобы изолировать одну ногу одной гуманизированной мыши, и распылите на медиальную сторону изолированной ноги 70% изопропанола. Нанесите антибиотик и обезболивающую мазь на место сбора.

С помощью иглы 25 калибра, расположенной под углом 90 градусов, проколите подкожную вену, чтобы собрать от 50 до 100 микролитров крови в пробирку для сбора крови, покрытую покрытием ЭДТА. Когда будет получен подходящий объем крови, надавите на это место стерильным куском марли, чтобы остановить кровотечение, прежде чем вернуть мышь в клетку. Затем используйте собранный образец периферической крови для оценки уровня восстановления иммунных клеток человека с помощью проточной цитометрии с использованием антител против человеческого CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 и мышиного CD45.

Для сбора свежих образцов кала поместите отдельные автоклавные бумажные пакеты в вытяжной шкаф и поместите в каждый пакет по одной мыши, пока каждое животное не испражнится. Затем верните мышей в клетку и с помощью стерильных щипцов перенесите каждый образец кала в одну пробирку объемом 1,5 миллилитра на мышь для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Через 24 и 48 часов после прекращения приема антибиотиков заполнить должным образом подготовленные источники трансплантатного материала фекальной микробиоты и аликвотировать образцы в анаэробной камере в анаэробных условиях.

Чтобы провести фекальную трансплантацию, доставьте 200 микролитров материала для трансплантации фекальной микробиоты через ротовой зонд каждому подопытному животному и распределите оставшийся размороженный материал на шерсть гуманизированных мышей или на подстилку клетки.