Создание поливалентной вакцины против везикул с наружной мембраной

Возьмем трансфекционные полиплексы, содержащие целевые плазмиды, связанные с полимером. Плазмиды кодируют вирусный антиген, слитый с пептидной меткой и аффинной меткой.

Инкубируйте полиплексы с клетками млекопитающих, которые интернализуют полиплексы внутри эндосом.

Полимер вызывает разрыв везикулы. Высвобождающиеся плазмиды экспрессируют вирусный антиген, который секретируется внеклеточно

Соберите надосадочную жидкость, содержащую антиген и загрязняющие вещества. Добавьте конкурирующее средство в низкой концентрации.

Загрузите его на колонку аффинной хроматографии.

Аффинные метки связываются со смолой колонки, иммобилизуя антиген, в то время как конкурирующий агент уменьшает неспецифическое связывание.

Подайте конкурирующий агент в низкой концентрации, удаляя слабосвязанные загрязнения.

Промойте с увеличением концентрации конкурирующих агентов, чтобы вытеснить сильно связанные антигены, элюируя их.

Введите бактериальные наружные мембранные везикулы, или OMV, с поверхностно связывающим захватывающим белком и инкубируйте.

Пептидные метки антигена связываются с захватывающими белками, образуя вакцину OMV с мультивалентным антигенным дисплеем.

Выполните очистку OMV SpyCatcher. Начните с центрифугирования бактериального раствора. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью мембранного фильтра толщиной 0,22 микрометра, затем сконцентрируйте его с помощью колонки из полых волокон. Отфильтруйте концентрат через мембранный фильтр толщиной 0,22 микрометра, затем центрифугируйте его при 150 000-кратном g при 4 градусах Цельсия в течение двух часов с помощью ультрацентрифуги и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Повторно суспендируйте осадки с помощью PBS и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Чтобы выполнить трансфекцию RBD-SpyTag, начните с выбора подходящей системы экспрессии эукариот и культивируйте клетки в течение ночи со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия после восстановления. Добавьте 20 микролитров HEK293F клеточного раствора в автоматический счетчик клеток. Запишите количество ячеек. Отрегулируйте концентрацию до 1 умножения на 10 до шестой клетки на миллилитр, а затем культивируйте клетки со скоростью 130 оборотов в минуту при температуре 37 градусов Цельсия в течение 4 часов.

Профильтруйте плазмиду RBD-SpyTag через мембранный фильтр толщиной 0,22 микрометра и добавьте 300 микрограммов плазмид в среду для культивирования клеток до тех пор, пока конечный объем не составит 10 миллилитров. Встряхивайте в течение 10 секунд. Нагрейте PEI до 65 градусов Цельсия на водяной бане. Смешайте 0,7 миллилитра PEI с 9,3 миллилитрами среды для клеточных культур и периодически встряхивайте в течение 10 секунд.

Добавьте раствор плазмиды в раствор PEI. Периодически встряхивайте смесь в течение 10 секунд и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Добавьте смесь в 280 миллилитров среды для культивирования клеток и культивируйте со скоростью 130 оборотов в минуту при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 дней.

Далее выполните очистку RBD-SpyTag. Начните с центрифугирования ячеек при 6000 умноженных на g при 25 градусах Цельсия в течение 20 минут. и используйте пипетку для сбора надосадочной жидкости. Соберите колонну с 2 миллилитрами агарозы никель-NTA и трижды промойте ее PBS.

Добавьте имидазол в надосадочную жидкость клетки, чтобы получить конечную концентрацию 20 миллимоляров и загрузите надосадочную жидкость клетки. Добавьте в 3 столбца объема PBS, содержащего 20 миллимоляров имидазола для промывки, и соберите промывочную фракцию. Градиентное элюирование с тремя объемами столбцов PBS, содержащими имидазол в низких и высоких концентрациях. Разбавьте дважды для каждой концентрации.

Для определения концентрации белка методом БЦА последовательно разводят стандартный раствор белка БСА от 2 до 0,0625 миллиграмм на миллилитр. Разведите очищенные OMV SpyCatcher и RBD-SpyTag в 10 раз. Затем смешайте рабочие растворы БЦА А и В в соотношении 50 к 1. Добавьте разбавленный раствор белка и смешайте с рабочим раствором BCA. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Измерьте поглощение на 562 нанометрах каждой лунки и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой.

Чтобы выполнить биоконъюгацию OMV SpyCatcher и RBD-SpyTag, смешайте OMV SpyCatcher в RBD-SpyTag в PBS в соотношении 40 к 1. Вертикально вращайте, чтобы перемешать смесь в течение ночи со скоростью 15 оборотов в минуту при температуре 4 градуса Цельсия. Выполните очистку OMV RBD с помощью раствора PBS с использованием процедуры, аналогичной очистке OMV SpyCatcher.