Методика редактирования генов в естественных клетках-киллерах с использованием CRISPR Cas9

Возьмем смесь CRISPR РНК, или crRNA, и транс-активирующей crRNA или тракрРНК.

Нагрейте смесь и дайте ей остыть, способствуя спариванию оснований тракрРНК с крРНК с образованием направляющей РНК, или гРНК.

Добавьте молекулярные ножницы, называемые ферментами Cas9, которые связываются с гРНК, создавая комплексы.

Добавьте комплексы Cas9-gRNA к Natural Killer или NK-клеткам, взвешенным в растворе для электропорации.

Введение одноцепочечных молекул ДНК, которые помогают в транспортировке комплексов Cas9-гРНК.

Переложите смесь в кювету и проведите электропорацию, создав временные поры в мембране для проникновения комплексов в клетку.

ГРНК связывается с участком-мишенью в геноме, позволяя Cas9 расщеплять ДНК.

Белки репарации связываются в месте разрыва и присоединяются к ДНК, часто вызывая ошибки вставки или делеции пары оснований. Полученная модификация нарушает работу целевого гена, делая его нефункциональным.

Перенесите генетически модифицированные клетки в подходящую среду для дальнейшего анализа.

В день электропорации наполните одну колбу Т25 8 миллилитрами свежей питательной среды с добавлением 100 МЕ на миллилитр ИЛ-2 в расчете на экспериментальное клеточное состояние, и поместите колбы во увлажненный до 37 градусов Цельсия и 5%_СО2

инкубатор.

Пока среда уравновешивается, добавьте от 3 до 4 x 10⁶ клеток в одно состояние, на 26 микролитров трансдукционной смеси в коническую пробирку и гранулируйте клетки центрифугированием. Затем промойте клетки три раза в 12 миллилитрах стерильного PBS за одну полоску, чтобы удалить всю FBS из клеточных суспензий.

Пока клетки промываются, ресуспендируйте каждую CRISPR РНК и трассерную РНК до 200 микромолярных конечных концентраций. Смешайте 2,2 микролитра каждой РНК CRISPR с одним 200-микромолярным объемом трассерной РНК на образец и нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 5 минут. Затем дайте образцам остыть до комнатной температуры и храните комплексы CRISPR РНК - индикаторные РНК при температуре минус 20 градусов Цельсия до их использования.

Для образования рибонуклеопротеиновых комплексов добавляют эндонуклеазу Cas9 к соответствующему комплексу CRISPR РНК - индикаторная РНК с закручиванием в течение 30-60 секунд и инкубируют полученные рибонуклеопротеиновые комплексы Cas9 при комнатной температуре в течение 15-20 минут.

После последней промывки добавьте весь объем добавки для электропорации из набора Nucleofector solution P3 и ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 20 микролитрах первичного раствора P3 4D-Nucleofector, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха.

Немедленно добавьте по 5 микролитров каждого рибонуклеопротеинового комплекса в соответствующую клеточную суспензию, и добавьте 1 микролитр 100 микромолярного усилителя электропорации Cas9 в клеточную смесь комплекса Cas9 рибонуклеопротеина. Перелейте 26 микролитров клеточного раствора рибонуклеопротеина Cas9 в отдельные лунки полоски Nucleocuvette Strip и осторожно постучите по полоске, чтобы убедиться, что образцы покрывают дно каждой лунки.

Затем запустите программу 4D-Nucleofector system EN-138. По окончании трансдукции дайте клеткам отдохнуть в течение трех минут. Затем добавьте 80 микролитров предварительно уравновешенной питательной среды в каждую кювету и аккуратно переложите образцы в одну колбу на одно условие при инкубации при 37 градусах Цельсия.