Получение рекомбинантных живых аттенуированных вирусов гриппа для вакцин

Начните с двунаправленных плазмид, несущих кДНК, кодирующую определенные вирусные эссенциальные белки штамма гриппа, адаптированного к холоду.

Введение нового набора двунаправленных плазмид, содержащих гемагглютинин и модифицированную кДНК нейраминидазы из другого штамма гриппа.

Введите в эту смесь реагент для трансфекции и инкубируйте до образования комплекса с плазмидами.

Переносите эти комплексы на культивируемые эпителиальные клетки человека, чтобы обеспечить проникновение плазмиды в клетку.

Двунаправленные плазмиды с двумя промоторами в противоположной ориентации позволяют производить вирусные белки и соответствующую им РНК.

Инкубируйте клетки при более низкой температуре.

Вирусные белки и вирусные РНК самоорганизуются, образуя адаптированные к холоду рекомбинантные вирусы гриппа с пониженной репликацией в более теплых условиях.

Наложение на клетки MDCK, сверхэкспрессирующие сиаловую кислоту, и модифицированные ферменты трипсина, которые обеспечивают прикрепление вируса и проникновение внутрь клеток.

Инкубируйте при одной и той же температуре, чтобы вызвать репликацию и производство новых вирусов.

Центрифугируйте и соберите рекомбинантные живые ослабленные вирусы гриппа, готовые к приготовлению вакцины.

Для начала поместите миллион 293Т-клеток в каждую лунку 6-луночного планшета с DMEM, содержащим 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% стрептококка. Далее приготовьте достаточное количество плазмидной смеси для трансфекции по 100 микролитров на лунку. Соедините по микрограмму каждой плазмиды и заполните пробирку предварительно нагретой клеточной средой Opti-MEM до 50 микролитров. В другую пробирку добавьте в два раза больше объема липофектамина 2000, что соответствует общему количеству трансфицируемой плазмиды, и долейте до 50 микролитров Opti-MEM.

Перед добавлением трансфекционной смеси в клетки дайте ей постоять 30 минут при комнатной температуре. Затем добавьте по 100 микролитров смеси для трансфекции в каждую лунку и переместите тарелку в инкубатор на 16 часов. На следующий день смените среду на DMEM с 0,3% BSA и 1% стрептококком от ручки. Тогда. переместите ячейки до 33 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на пять часов.

Через пять часов добавьте слой из миллиона гриппопроницаемых клеток MDCK в DMEM, дополненный трипсином. Сокультуры выдерживают в течение 2–3 дней в режиме инкубации при температуре 33 градуса Цельсия для генерации и усиления вируса. Позже очистите от мусора с помощью пятиминутного отжима 260 g, затем соберите надосадочную жидкость.