Анализ in vitro для оценки цитотоксичности естественных клеток-киллеров в отношении раковых клеток

Возьмите многолуночный планшет, содержащий естественные киллеры, или NK-клетки, и раковые клетки. Контрольные лунки содержат только раковые клетки.

Центрифуга для облегчения клеточного контакта.

инкубировать. Активирующие рецепторы на NK-клетках связываются с поверхностными лигандами раковых клеток, заставляя NK-клетки выделять гранулы, содержащие цитотоксические молекулы.

Эти молекулы создают поры мембраны раковых клеток и вызывают апоптоз, высвобождая внутриклеточное содержимое, включая лактатдегидрогеназу или ЛДГ.

Добавьте моющее средство, чтобы лизировать раковые клетки в контрольных лунках для максимального высвобождения ЛДГ.

Центрифугируйте и перенесите порцию ЛДГ-содержащих надосадочной жидкости в планшет для анализа.

Добавьте реактив для анализа и инкубируйте.

ЛДГ превращает лактат в пируват, снижая уровень НАД+. Diaphoraze использует NADH для восстановления соли тетразола, образуя продукт формазана красного цвета.

Добавьте кислый раствор, чтобы остановить ферментативную реакцию.

Используйте считыватель микропланшетов для измерения абсорбции формазана в лунках.

Интенсивность формазана пропорциональна количеству лизированных раковых клеток в тестовой лунке, что указывает на цитотоксичность NK-клеток в отношении раковых клеток.

Во-первых, приобретите 96-луночный планшет с круглым дном, обработанный культурой, и настройте его, как указано в таблице 1 текстового протокола. Центрифугируйте пластину для анализа при 250-кратном избытке в течение 4 минут, чтобы убедиться в том, что эффектор и клетки-мишени находятся в контакте. Далее инкубируйте тарелку во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 5 часов.

За 45 минут до сбора надосадочной жидкости добавьте 10 микролитров 10-кратного лизисного раствора в максимальные лунки для высвобождения ЛДГ клетки-мишени и верните планшет в увлажненную камеру. Когда инкубация будет завершена, центрифугируйте планшет при 250-кратном g в течение 4 минут. Затем с помощью многоканального дозатора перекачайте 50 микролитров аликвот из каждой лунки в свежую 96-луночную пластину для плоскодонного анализа.

Добавьте по 50 микролитров реактива для анализа в каждую лунку пробирной пластины. Накройте тарелку фольгой, чтобы защитить ее от света, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого добавьте в каждую лунку по 50 микролитров стоп-раствора. Обязательно прочитайте показания на планшете в течение 1 часа после добавления стоп-раствора и запишите поглощение на 490 нанометрах.