Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 3:32 мин. • July 8th, 2025
Возьмите микролуночный планшет, покрытый фрагментами рекомбинантного фибронектина, и добавьте активированные мышиные CD8-положительные Т-клетки.
Введение ретровирусных векторов, содержащих трансгенную РНК, кодирующую химерный антигенный рецептор или CAR.
Накройте пластину крышкой и запечатайте ее в пакет, чтобы избежать загрязнения. Центрифугируйте планшет с низкой скоростью, чтобы облегчить взаимодействие вируса с клеткой.
Фибронектин связывается с вирусом и клеткой, колокализуя их, усиливая вирус-опосредованный перенос генов.
После центрифугирования снимите герметичный пакет и инкубируйте планшет в физиологических условиях.
Оболочка вирусного вектора сливается с клеточной мембраной, высвобождая вирусную РНК и ферменты.
Вирусные ферменты ретранскрибируют высвобожденную РНК и интегрируют полученную ДНК в геном хозяина, позволяя клеткам экспрессировать поверхностно связанные CAR.
CAR содержит антигенсвязывающий домен, специфичный к антигену-мишени, и сигнальные домены для активации Т-клеток.
Антиген-специфичные CAR-Т-клетки готовы к последующему анализу.
В день 1 приготовьте пластины, покрытые фрагментами человеческого фибронектина, добавив 0,5 миллилитра фибронектина в лунки 24-луночного планшета и инкубируя его в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.
На следующий день удалите раствор фибронектина и добавьте 1 миллилитр 2% BSA в PBS на лунку. Выдержите тарелку при комнатной температуре в течение 30 минут, а обработанные лунки промойте 1 миллилитром стерильного ПБС. Тарелка готова к использованию после удаления моющего раствора.
Подсчитайте активированные CD8 Т-клетки с помощью трипанового синего цвета. Соберите их центрифугированием и повторно суспендируйте в 5 миллионах жизнеспособных клеток на миллилитр для трансдукции. Добавьте по 100 микролитров активированной клеточной суспензии CD8 в каждую лунку пластины, покрытой фибронектином. Затем добавьте от 1,5 до 2 миллилитров ранее приготовленной вируссодержащей среды и перемешайте с помощью вращательных движений, чтобы равномерно распределить клетки.
Запечатайте пластину в пакет с застежкой-молнией и центрифугируйте при 2000 умноженных на g в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия. Снимите планшет с центрифуги и отнесите его в шкаф биологической безопасности. Осторожно снимите полиэтиленовый пакет и убедитесь, что внешняя сторона пластины не загрязнена средой. Перенесите тарелку в инкубатор с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.
Через 4 часа достаньте по 1 миллилитру среды из каждой лунки. Замените его 1 миллилитром предварительно подогретой полной Т-клеточной среды и поставьте пластину обратно в инкубатор.