Методика получения антиген-специфичных CAR-Т-клеток

Возьмите микролуночный планшет, покрытый фрагментами рекомбинантного фибронектина, и добавьте активированные мышиные CD8-положительные Т-клетки.

Введение ретровирусных векторов, содержащих трансгенную РНК, кодирующую химерный антигенный рецептор или CAR.

Накройте пластину крышкой и запечатайте ее в пакет, чтобы избежать загрязнения. Центрифугируйте планшет с низкой скоростью, чтобы облегчить взаимодействие вируса с клеткой.

Фибронектин связывается с вирусом и клеткой, колокализуя их, усиливая вирус-опосредованный перенос генов.

После центрифугирования снимите герметичный пакет и инкубируйте планшет в физиологических условиях.

Оболочка вирусного вектора сливается с клеточной мембраной, высвобождая вирусную РНК и ферменты.

Вирусные ферменты ретранскрибируют высвобожденную РНК и интегрируют полученную ДНК в геном хозяина, позволяя клеткам экспрессировать поверхностно связанные CAR.

CAR содержит антигенсвязывающий домен, специфичный к антигену-мишени, и сигнальные домены для активации Т-клеток.

Антиген-специфичные CAR-Т-клетки готовы к последующему анализу.

В день 1 приготовьте пластины, покрытые фрагментами человеческого фибронектина, добавив 0,5 миллилитра фибронектина в лунки 24-лун