Инъекция обогащенной тромбоцитами плазмы в рассеченное ахиллово сухожилие крысы

Поместите крысу-реципиента под наркозом с бритой задней конечностью на теплую подушечку под препарирующим микроскопом.

Надрежьте кожу и рассеките фасцию, обнажив комплекс ахиллова сухожилия.

Удалите подошвенное сухожилие и иссеките небольшой сегмент из ахиллова сухожилия, создав очаг поражения.

Зашите разрез и дайте крысе восстановиться.

Соберите цельную кровь от генетически иной донорской крысы, смешанную с антикоагулянтом.

Центрифуга для получения нижней фазы эритроцитов и верхней фазы обогащенной тромбоцитами плазмы, или PRP.

Перенесите PRP в пробирку и подавите тромбоциты. Частично удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте тромбоциты для получения концентрированного PRP.

Добавьте хлорид кальция и инкубируйте, чтобы вызвать активацию тромбоцитов. Затем введите активированные тромбоциты в ушивный участок реципиента.

Активированные тромбоциты высвобождают специфические цитокины и факторы роста, которые индуцируют восстановление сухожилий в месте поражения.

Начните с взвешивания и бирки для ушей крысы. После подтверждения соответствующего уровня седативного эффекта путем щипкования пальцев ног нанесите капли воды на роговицу животного и удалите шерсть с левой задней конечности. Продезинфицируйте открытые участки кожи разбавлением раствора изобетадина в соотношении 1:10 и положите животное на грелку при температуре 20 градусов Цельсия под микроскопом.

В положении бокового дебета с левой задней конечностью в верхнем положении захватите лапу левой задней конечности щипцами и с помощью тонких ножниц сделайте боковой разрез кожи диаметром от 20 до 25 миллиметров вокруг ахиллова сухожилия. Рассеките фасцию, чтобы обнажить комплекс ахиллова сухожилия, и удалите подошвенное сухожилие.

Разрежьте ахиллово сухожилие поперечно на 5 миллиметров проксимальнее его пяточного отверстия и удалите участок длиной 5 миллиметров. Затем используйте рассасывающуюся пряжу в непрерывных швах, чтобы закрыть фасцию и кожу, и поместите крысу под источник тепла с мониторингом до полного восстановления. Пока животные-реципиенты выздоравливают, соберите 20 миллилитров цельной крови из сердца одной донорской крысы на каждое подопытное животное в отдельные пробирки, содержащие 3,2% буферизованного цитрата натрия.

Чтобы получить обогащенную тромбоцитами плазму, центрифугируйте кровь и с помощью пластиковой передаточной пипетки тщательно собирайте верхнюю фазу, содержащую PRP, во вторую пластиковую пробирку. Определите объем собранного PRP и измерьте количество тромбоцитов на гематологическом анализаторе.

Снова центрифугируйте PRP и осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пластиковую пробирку. Оставшийся объем в пробирке PRP должен составлять около 2/3 объема, необходимого для достижения 2,5 x 10⁶ тромбоцитов на микролитр. Далее аккуратно ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу с помощью пипетирования. Измерьте количество тромбоцитов в этой концентрированной обогащенной тромбоцитами плазме, добавив обратно соответствующий объем аутологичной бедной тромбоцитами плазмы для достижения целевой концентрации по мере необходимости.

Активируйте тромбоциты с помощью 50 микролитров хлорида кальция на миллилитр PRP в течение примерно 1 часа при комнатной температуре. Затем загрузите тромбоциты в шприц объемом 1 миллилитров, оснащенный иглой 21-го калибра, и введите 50 микролитров тромбоцитов непосредственно в место наложения швов каждого животного.