Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 2:43 мин. • July 8th, 2025
Начните с замороженного полимерного раствора, содержащего положительно заряженные полимеры.
Разморозьте полимерный раствор до тех пор, пока он не достигнет комнатной температуры.
Добавьте буфер и вихрь для равномерного перемешивания, получив однородный раствор.
Введите мишенную мРНК в раствор полимера в равном соотношении для оптимальной реакции.
Инкубируйте для того, чтобы положительно заряженные полимеры взаимодействовали с отрицательно заряженными фосфатными группами в мРНК посредством электростатических взаимодействий.
Это облегчает встраивание мРНК в структуру полимера, образуя наночастицы мРНК-полимерных комплексов или полиплексов.
Перенесите эти полиплексы в пробирку, содержащую воду, не содержащую РНКазы.
Смешайте их и дайте выпасть в осадок полиплексам.
Введите буфер, содержащий сахарозу, и заморозьте его. Сахароза действует как криопротектор, поддерживающий структурную целостность полиплексов.
Затем проведите сублимационную сушку, чтобы удалить любые следы воды.
Храните его при низкой температуре в качестве кандидата на мРНК-вакцину для будущего использования.
Для образования полиплексов разморозьте ранее приготовленные полимеры С-6 пептид поли-бета-аминоэфиров и вортексируйте раствор. После пипетирования полимера перемешайте вверх и вниз, приготовьте 12,5-миллимолярный раствор в ацетате натрия. Вонзите раствор вихрем и подождите 10 минут.
Далее готовят мРНК в дозе 0,5 миллиграмма на миллилитр и перемешивают с помощью пипетирования. Снова перебейте полимерный раствор вихрем. Затем смешайте раствор генетического материала в растворе полимера в соотношении один к одному в микроцентрифужной пробирке и инкубируйте пробирку при температуре 25 градусов Цельсия в течение 30 минут в термоблоке. После инкубации осадите смесь одной-двумя водами, не содержащими РНКазы, добавив образец в микроцентрифужную пробирку, содержащую воду.
Затем, чтобы включить вспомогательные вещества, добавьте 20-миллимолярный HEPES и 4-процентный раствор сахарозы в том же объеме, что и смесь мРНК и поли-бета-аминоэфиров, и перемешайте с помощью пипетирования. Для лиофилизации, после замораживания раствора полиплекса при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение одного часа, выполните первичную сушку, затем немедленно храните полиплексы при температуре минус 20 градусов Цельсия, чтобы избежать регидратации.