Создание гуманизированной модели мыши с искусственным иммунитетом против ВИЧ

Подготовьте мышь-реципиента под наркозом с сильно ослабленным иммунитетом.

Сделайте разрез, чтобы обнажить почку и создать отверстие в капсуле почки.

Возьмите иглу для имплантата, содержащую ткань тимуса плода человека и клетки печени плода, суспензированные в смеси студенистых белков.

Клетки включают в себя сконструированные гемопоэтические стволовые клетки, или ГСК, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы, или CAR, направленные против ВИЧ.

Имплантируйте клеточную суспензию и ткань тимуса под капсулу, затем закройте разрез.

Затем ретроорбитально введите CAR-экспрессирующие ГСК и дайте мыши восстановиться.

В почках смесь студенистых белков полимеризуется в матрикс, удерживая ГСК в месте имплантации.

Матриксные ГСК мигрируют в тимус, дифференцироваясь в функциональные Т-клетки человека.

Между тем, ретроорбитально введенные ГСК достигают костного мозга и дифференцируются в функциональные В-клетки человека, моноциты и NK-клетки.

Мышиная модель с иммунной системой человека против ВИЧ уже готова.

Высыпаем кусочки тимуса и медиум из колбы в 60-миллиметровую посуду. Охладите наконечники пипеток с положительным смещением, поместив их в открытые 1,5-миллилитровые стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой на льду. Также поместите на лед клеточные гранулы и объем желатиновой белковой смеси, такой как Матригель.

Обезболите мышей-реципиентов инъекционным анестетиком в соответствии с утвержденным протоколом на животных. Проверьте уровень анестезии мыши, сдавливая лапу. Отсутствие реакции на щипки свидетельствует о хирургической плоскости анестезии.

Выбрейте левую сторону каждой мыши от бедра до плеча, между центром спины и животом. Подкожно вводят 6 миллиграмм на килограмм разведенного карпрофена в плечо или паховый треугольник животного. Промойте канюлю троакара с ПБС в 60-миллиметровой посуде. С помощью пары тупых изогнутых щипцов поместите кусочек тимуса из 60-миллиметровой чашки прямо в отверстие канюли, затем потяните назад за троакар, чтобы аспирировать ткань в канюлю.

Затем с помощью пипетки прямого вытеснения и охлажденного наконечника добавьте 5 микролитров холодной смеси желатинового белка в пробирку с клеточной гранулой и осторожно перемешайте, чтобы получить клеточную суспензию. Пипеткой введите клеточную суспензию в отверстие канюли и медленно потяните назад на троакар, чтобы загрузить иглу.

Промокните выбритый участок мыши повидон-йодом с последующим приемом изопропанола три раза. Определите самое темное пятно под кожей, которое указывает на расположение селезенки. Почка находится примерно в 5 миллиметрах дорсально от селезенки.

Обеспечив подходящий уровень анестезии за счет отсутствия реакции на защемление лапы, используйте изогнутые щипцы для подтяжки кожи, а хирургическими ножницами сделайте 15-миллиметровый разрез на коже параллельно селезенке. Затем сделайте аналогичный надрез в слое брюшины ниже.

У самцов почка хорошо заметна, поэтому выдавливается просто при надавливании на живот. Поддержите почку с помощью кровоостанавливающего средства или пары изогнутых тупых щипцов. У женщин яичники, как правило, блокируют почку от легкого извлечения. С помощью гемостата подхватить яичник и аккуратно обнажить почку.

С помощью щипцов с игольчатым наконечником проделайте крошечное отверстие на заднем конце капсулы почки. Вставьте троакар в это отверстие и вдоль почки до тех пор, пока отверстие канюли не будет полностью закрыто капсулой почки. Аккуратно выдавите ткань под капсулой почки и вытяните троакар обратно. Используйте изогнутые щипцы, чтобы убедиться, что кусочек тимуса не выходит вместе с иглой.

Затем поднимите брюшину вверх с помощью щипцов и аккуратно с помощью гемостата верните почку на место. Завяжите один двухузловой стежок хирургическим швом в области брюшины. Кроме того, поместите два автоматических зажима для намотки, чтобы закрыть кожу.

Теперь смешайте трансдуцированные CD34-положительные клетки и аспирируйте 0,5 x 10⁶ клеток объемом 100 микролитров в инсулиновый шприц. Введите эти клетки мышке с помощью инъекции в ретроорбитальную вену.

После инъекции нанесите небольшую каплю глазной смазки на каждый глаз и положите мышь на бок обратно в клетку. После имплантации всех мышей убедитесь, что животные пришли в сознание и передвигаются, прежде чем возвращать их в помещение для проживания.