$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Начните с культивирования стволовых клеток костного мозга.
Введите буфер трипсин-ЭДТА, чтобы отделить клетки и разбить клеточные сгустки, образуя одноклеточную суспензию.
Центрифугуем, затем удалите надосадочную жидкость. Повторно суспензируйте гранулу свежей средой.
Переложите суспензию в шприц и подсоедините его к блоку мембранного фильтра.
Нажмите на поршень и выбросьте фильтратсодержащую среду.
Отсоедините фильтр. Наполните шприц свежей средой. Снова подключите фильтр и быстро нажмите на поршень.
Давление жидкости вынуждает клетку приближаться к порам фильтра.
При этом образуется сферическая плазматическая мембранная везикула или PMV.
Эти везикулы содержат клеточные компоненты и органеллы, окруженные мембраной.
Исследуйте фильтрат под инвертированным фазово-контрастным микроскопом, чтобы увидеть полупрозрачные сферические везикулы.
Размеры везикул совпадают с размером пор фильтрующей мембраны, что подтверждает образование PMV.
Для получения PMV сначала культивируют PMSC мышей в полной культуральной среде DMEM в одной лунке шестилуночного планшета в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, промойте лунку 0,5 миллилитрами PBS, не содержащего кальция, и отделите клетки 0,5 миллилитрами 0,25% трипсина-ЭДТА.
Через три минуты при 37 градусах Цельсия несколько раз постучите по тарелке ладонью, чтобы облегчить диссоциацию клеток и остановить переваривание 1 миллилитром питательной среды. Переложите клетки в 5-миллилитровую коническую пробирку для центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в 4 миллилитрах свежей питательной среды. Затем разделите клетки между двумя лунками нового шестилуночного планшета и верните планшет в инкубатор для клеточных культур на 24 часа.
На следующий день соберите клетки из одной лунки путем расщепления трипсина, как только что продемонстрировано, повторно суспендируя гранулу в 0,5 миллилитрах свежей питательной среды после сбора центрифугированием. Загрузите клетки в шприц с инсулином объемом 1 миллилитр, и прикрепите шприц к фильтрующему блоку. Быстро нажмите на поршень, чтобы выдавить ячейки через фильтр и сбросить выдавленную среду. Затем загрузите и пропустите через фильтр 0,5 миллилитров дополнительной питательной среды, как показано только что, собирая среду из второй экструзии.
Высадите 150 микролитров собранной среды в 35-миллилитровую стеклянную посуду с дном и дайте пузырькам отстояться около 10 минут. Затем подтвердите наличие PMV под инвертированным фазово-контрастным микроскопом, оснащенным ПЗС-камерой, с использованием объектива с 20-кратным увеличением.