Пероральная доставка трансформированных дрожжевых клеток в иммунную систему кишечника мыши

Начните с ротовой пробирки, содержащей суспензию генетически трансформированных, ауксотрофных дрожжей, которые не могут производить нуклеотидное основание урацила.

Вставьте оральную трубку в рот сдерживаемой мыши и направьте ее вниз к животу.

Вводите дрожжевую суспензию непосредственно в желудок, позволяя ей в конечном итоге достичь тонкого кишечника.

Тонкая кишка содержит эпителиальные клетки, а нижележащие пейеровы участки богаты иммунными клетками.

Микроскладчатые клетки, специализированные эпителиальные клетки кишечника рядом с пейеровыми пятнами, поглощают дрожжевые клетки и интернализуют их в везикулы.

Эти везикулы перемещаются по клеткам и высвобождают дрожжевые клетки в нижележащий участок Пейера.

Выделите пейерову пластырь из принесенного в жертву кишечника мыши и получите однородную клеточную суспензию.

Культивируют эту клеточную суспензию на дрожжеселективной среде, содержащей урацил.

Ауксотрофные дрожжи используют урацил и размножаются с образованием колоний, подтверждая доставку трансформированных дрожжевых клеток в иммунную систему кишечника мыши.

После подготовки культур дрожжей по текстовому протоколу с помощью гемоцитометра определите концентрацию клеток, и отрегулируйте до 10 до девяти клеток на миллилитр. Гранулируйте клетки центрифугированием в 2500 раз больше g в течение трех минут. Затем слейте надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки, добавив соответствующий объем стерильной воды, и аккуратно пипетируйте вверх и вниз.

Закрепите подходящую измерительную иглу на стерильном шприце объемом 1 миллилитр и загрузите образец дрожжей, исключив пузырьки воздуха. Загрузите дополнительный шприц со стерильной водой, чтобы зондировать контрольных мышей. Используя недоминантную руку, возьмите в руки мышь, которую нужно зацепить, и указательным и большим пальцами плотно обхватите кожу вокруг шеи. Подверните хвост под мизинец. Убедитесь, что рукоятка надежно закреплена и не позволяет мыши двигать головой.

Затем аккуратно введите иглу для зонда в пищевод мыши, наклоняя иглу вдоль нёба и задней части горла, держась немного левее центра. Подождите, пока мышь проглотит луковицу иголки. Если вы чувствуете сопротивление или мышь задыхается, осторожно извлеките иглу и попробуйте еще раз, чтобы найти пищевод.

После того, как мышь проглотит колбу иглы, осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы ввести дрожжи непосредственно в желудок мыши. Аккуратно извлеките иглу для зонда из желудка мыши и пищевода и верните мышь в клетку. Убедитесь, что мышь дышит и движется нормально, чтобы убедиться, что зондирование выполнено правильно.

Пожертвовав мышью в соответствии с текстовым протоколом, расположите ее так, чтобы живот был полностью открыт, и используйте 70% этанол для опрыскивания области живота. Ножницами сделайте поперечный разрез через шерсть и кожу. Затем вручную подденьте разрез, чтобы еще больше обнажить брюшину, тонкую слизистую оболочку серозы, которая покрывает органы брюшной полости. Аккуратно приподнимите брюшину и сделайте поперечный разрез, чтобы обнажить кишечник.

Затем с помощью тупых щипцов осторожно оторвите тонкую кишку от брыжеечных артерий, жира и других тканей. Обнажите тонкую кишку от желудка в верхнем левом квадранте брюшной полости мыши до слепой кишки, большого кармана кишечной ткани в начале толстой кишки.

Затем изолируйте пятна Пейера, ища от 1 до 2 миллиметровых примерно круглых участков непрозрачной ткани вдоль тонкой кишки. Затем с помощью изогнутых ножниц для препарирования отрежьте купол пейерова пятна, оставив края, чтобы гарантировать, что никакая из окружающих тканей не будет собрана.

Перенесите рассеченные пейеровы патчи в полный IMDM. Затем вылейте раствор с подвешенными пластырями Пейера на клеточное ситечко толщиной 40 микрометров. После промывания пластырей Пейера полным IMDM с помощью поршня из шприца объемом 1 миллилитр аккуратно разбить ткань и собрать клетки в 50-миллилитровую трубку. Гранулируйте процеженные ячейки при 1 800 об/мин в течение семи минут. Затем подождите и проанализируйте ячейки по текстовому протоколу.