Генерация антиангиогенных опухолеассоциированных нейтрофилов

Возьмем, к примеру, опухоль меланомы мыши, содержащую опухолеассоциированные нейтрофилы, или ТАН.

ТАН проявляют повышенную активность фермента никотинамида фосфорибозилтрансферазы, или NAMPT, стимулируя ангиогенез, пролиферацию кровеносных сосудов в опухолях и способствуя росту опухоли.

Измельчите ткань и добавьте ферменты, чтобы разрушить тканевый матрикс, разрыхлив клетки.

Отфильтруйте суспензию через сетчатое фильтр и центрифугу, чтобы гранулировать клетки.

Добавьте лизирующий буфер для лизирования эритроцитов, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую клеточный мусор.

Вводить антитела для блокирования клеточных Fc-рецепторов, тем самым избегая неспецифического иммуноокрашивания.

Введите меченный флуорофором коктейль антител, специфичный для поверхностных маркеров на TAN, и краситель для различения мертвых клеток.

С помощью FACS изолируйте меченые флуорофорами жизнеспособные TANs и перенесите их на микропланшет.

Добавьте в выбранные лунки ингибитор, блокирующий активность NAAMPT, и инкубируйте.

Используйте клетки для оценки их способности стимулировать ангиогенез. Обработанные ингибиторами TANs демонстрируют сниженный ангиогенез по сравнению с необработанными TAN.

Для выделения нейтрофилов, ассоциированных с опухолью, поместите пять опухолей в лунку в отдельные лунки стерильного шестилуночного планшета по мере их сбора и с помощью стерильных ножниц измельчите опухоли на кусочки размером от 2 до 3 миллиметров. Далее расщепляют фрагменты опухоли с 1 миллилитром коллагеназы на основе диска, раствором ДНКазы I в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом с влажностью, перемешивая образцы 10-миллилитровым шприцем каждые 15 минут.

В конце инкубации отфильтруйте клетки через 100-микрометровые сетчатые фильтры в одну 15-миллилитровую пробирку на лунку, чтобы удалить непереваренные волокна, и добавьте PBS до конечного объема 15 миллилитров. Соберите диссоциированные клетки центрифугированием и лизируйте эритроциты с помощью 1 миллилитра буфера для лизиса на пробирку.

После смешивания соедините содержимое из каждой пробирки в одну 15-миллилитровую пробирку, остановив реакцию через две минуты 11 миллилитров полной среды 4 градуса Цельсия. После центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре ПББС и блокируйте любое неспецифическое связывание тремя микролитрами антител, заблокированных FC, на 15 минут на льду.

В конце инкубации пометьте клетки антителами к CD11b и Ly6G и любыми другими антителами, представляющими интерес, а также DAPI для 30-минутной инкубации на льду, защищенном от света. По окончании инкубации промойте клетки в 14 миллилитрах PBS и повторно суспендируйте гранулы в соотношении 1 х 10⁷ клеток на миллилитр свежей полной средней концентрации на льду.

Затем отсортируйте CD11b-положительные Ly6G-высокие DAPI-отрицательные нейтрофилы на флуоресцентно-активируемом сортировщике клеток в соответствии со стандартными протоколами сортировки, проверяя чистоту выделенных нейтрофилов на проточном цитометре в конце сортировки. Для ингибирования нейтрофилов in vitro, ассоциированных с опухолью, засейте ее в 1,5 раза по 10 до пятой части отсортированных нейтрофилов в каждую из двух лунок 96-луночного U-образного планшета и добавьте FK866 до конечной концентрации 100 наномолей в полной среде в одну лунку и равный объем полной среды в другую лунку. После двух часов в инкубаторе для клеточных культур клетки дважды промыть PBS и повторно суспендировать гранулы в PBS в соответствующей концентрации для последующего введения.