Методика конъюгации авидина и биотина для презентации целевых антигенов на БЦЖ Mycobacterium bovis

Начните с суспензии Mycobacterium bovis BCG, обработанной неионогенным поверхностно-активным веществом, чтобы предотвратить слипание бактерий.

Далее добавьте реагент для биотинилирования и инкубируйте.

Этот реагент биотинилирования, представляющий собой комплекс биотина, объединенный в функциональный линкер, способствует связыванию молекул биотина с поверхностными белками бактерий, мечая бактерии.

После инкубации центрифугируйте меченую биотином бактериальную суспензию для удаления непрореагировавшего реагента биотинилирования.

Восстановите суспендию бактерий в буфере. Добавьте раствор авидин-фьюжн белка, рекомбинантного белка, содержащего целевой антигенный домен, слитый с мономерным авидином.

Во время инкубации авидин связывается с биотином, способствуя модификации бактериальной поверхности целевыми антигенами.

Центрифугируйте суспензию для удаления несвязанных гибридных белков.

Ресуспендируйте покрытые антигеном бактерии в буфере, содержащем неионогенное поверхностно-активное вещество. Антигенное покрытие бактерий может усилить их способность вызывать иммунные реакции.

Работайте в шкафу биобезопасности с использованием средств индивидуальной защиты, потому что БЦЖ является патогеном II уровня.

Чтобы биотинилировать поверхность клеток БЦЖ, сначала вырастите клетки на шейкерной платформе до нужной плотности. Соберите около 1 миллиарда клеток и промойте их три раза, используя 500 микролитров ледяного ПБСТ, не содержащего эндотоксинов. Затем раскрутите клетки вниз и суспензируйте их в стерильном PBS, не содержащем эндотоксинов. Далее приготовьте свежий 10-миллимолярный биотин Sulfo-NHS SS в стерильной фильтрованной воде. Затем инкубируйте бактерии в 1 миллилитре бульона, содержащем 0,5 миллимоляра биотина Sulfo-NHS SS. Проводят инкубацию при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем трижды промойте помеченные бактерии 500 микролитрами ледяного PBST, чтобы удалить непрореагировавший реагент. Затем повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре PBST.

Смешайте 500 миллионов биотинилированных БЦЖ с гибридным белком авидина для получения конечной концентрации белка 10 микрограммов белка на миллилитр. Дайте такой реакции идти в течение часа при комнатной температуре на шейкере. Затем трижды промойте бактерии 500 микролитрами ледяного PBST.