Методика культивирования нейронов гиппокампа мыши

Возьмите собранного детеныша мыши гиппокамп в буфер.

Разрежьте гиппокамп на более мелкие фрагменты и перенесите их в коническую трубку.

Промойте салфетку с буфером. Как только осядут осядки, удалите буфер. Теперь добавьте свежий буфер и трипсин.

Во время инкубации трипсин, протеолитический фермент, переваривает внеклеточный матрикс ткани, расслабляя нейроны гиппокампа.

Промойте переваренную ткань буфером.

Как только осядут осядки, удалите буфер. Добавьте свежий буфер и многократно пипетируйте ткань, чтобы механически диссоциировать ее, получая одноклеточную суспензию.

Как только непереваренная ткань осядет, перенесите клеточную суспензию на покрытые поли-L-лизином покровные стекла с восковыми подложками внутри культуральной пластины, содержащей среду.

Клетки прикрепляются к поверхностям, покрытым поли-L-лизином, посредством электростатических взаимодействий.

Теперь поместите прикрепленные к нейронам покровные стекла лицевой стороной вниз в чашку, содержащую корковые глиальные или ненейрональные клетки в среде, не содержащей сыворотки.

В культуре восковые подложки предотвращают прямой контакт между нейронами и глиальными клетками, создавая микросреду, в которой факторы, секретируемые глиальными клетками, способствуют выживанию и созреванию нейронов.

Для начала препарируйте от шести до восьми гиппокампов у однодневных щенков в постнатальном периоде с помощью среды HBSS в чашке Петри. Разрежьте гиппокамп ножницами для пресечения на более мелкие кусочки, и переложите их из посуды в 15-миллилитровую трубку. Дважды промойте гиппокампы 5 миллилитрами HBSS, а после мытья оставьте их в 4,5 миллилитрах HBSS.

Добавьте 0,5 миллилитра 2,5% трипсина в 4,5 миллилитра HBSS, и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, переворачивая трубку каждые 5 минут. Хорошо переваренный гиппокамп должен стать липким и образовать скопление. При необходимости продлите варение еще на 5 минут.

Вымойте гиппокамп с помощью HBSS три раза по 5 минут за одно мытье. После промывки добавьте 2 миллилитра HBSS и пипеткой вверх и вниз пипеткой Пастера 15 раз. Разотрите ткань с помощью отполированной огнем пипетки Пастера 10 раз и дайте пробирке отдохнуть в течение пяти минут, пока все кусочки не опустятся на дно. Повторяйте растирание с оставшимися кусками, пока большая их часть не исчезнет.

Затем с помощью наконечника пипетки объемом 1 миллилитр аккуратно перенесите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные нейроны, на посуду. Добавьте его непосредственно в предварительно инкубированную среду для сервировки и осторожно встряхните тарелку. Через 2 – 4 часа после посева проверьте облицовку посуды с помощью светового микроскопа. Большинство нейронов должны были быть прикреплены к покровному листу.

С помощью щипцов с тонким наконечником переверните покровные стекла к чашкам для питания глиальных клеток, содержащим предварительно подготовленную среду для культуры нейронов, стороной восковой точки вниз. Нейроны могут расти в кормушках для клеток глии до одного месяца. Подкармливайте нейроны раз в семь дней 1 миллилитром свежей питательной среды для нейронов.