Создание культуры первичных нейронов низкой плотности из замороженных эмбриональных нейронов

Начните с криовиала, содержащего криоконсервированные эмбриональные нейроны, и поместите его в нагревательный блок для контролируемого размораживания.

Затем перенесите размороженные нейроны в трубку и разбавьте их нейробазальной средой по каплям, чтобы сбалансировать осмотическое давление и предотвратить лизис клеток.

В результате образуется однородная суспензия с равномерно диспергированными нейронами.

Поместите разведенную нервную суспензию на многолуночный планшет, покрытый поли-L-лизином, содержащий нейробазальную среду, обогащенную питательными веществами и антибиотиками.

Инкубируйте для того, чтобы положительно заряженный поли-L-лизин взаимодействовал с нейронами посредством электростатических взаимодействий, способствуя их адгезии.

Снабжайте лунки свежими нейробазальными средами.

Инкубируйте клетки в одной и той же среде во влажных условиях, чтобы предотвратить испарение среды.

Эмбриональные нейроны используют питательные вещества и растут за счет развития нейронных процессов и формирования первичных нейронов.

Нейробазальная среда поддерживает первичные нейроны, которые кажутся широко разнесенными, генерируя первичную культуру низкой плотности с нейронными связями.

Начните с покрытия 96-луночного микропланшета 100 микролитрами поли-L-лизина на лунку. Далее инкубируйте пластины на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации удалите раствор поли-L-лизина. Дважды вымойте тарелки стерилизованной водой и один раз свежей питательной средой без добавок. Поставьте тарелки сушиться. Сухие тарелки можно упаковывать и хранить до одного месяца при температуре 4 градуса Цельсия.

Чтобы приступить к клеточному посеву, добавьте по 50 микролитров питательной среды в каждую лунку в покрытой покрытием пластине. Заполните периферийные лунки 200 микролитрами стерилизованной воды и инкубируйте пластину в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Извлеките криовиальный нейрон из резервуара с жидким азотом и поместите его в термоблок с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы частично разморозить его содержимое. С помощью пипетки объемом 1 миллилитр с широким наконечником медленно переложите содержимое флакона по каплям в стерильную 50-миллилитровую пробирку. Промойте пустой криовиал 1 миллилитром питательной среды комнатной температуры. Перелейте раствор для полоскания в 50-миллилитровую пробирку, содержащую клеточную суспензию.

Далее добавьте по каплям 9 миллилитров питательной среды комнатной температуры в 50-миллилитровую пробирку, доведя объем до 11 миллилитров. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра перенесите клеточную суспензию в резервуар. Теперь, используя многоканальную пипетку с широкими наконечниками, дозируйте клеточную суспензию с конечным количеством 1,0 x 10⁴ ячейки на лунку в 96-луночный планшет с покрытием.

Инкубируйте нейроны в течение 1-2 часов при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа. Затем замените питательную среду на 100 микролитров предварительно подогретой питательной среды и снова инкубируйте в тех же условиях.