Культивирование флуоресцентных возбуждающих нейронов из мозга трансгенного детеныша мыши

Возьмем мозг трансгенного мышиного щенка.

Удалите мозжечок и рассеките головной мозг. Отделите кортико-гиппокампальную ткань, содержащую возбуждающие нейроны, экспрессирующие флуоресцентные белки.

Перенесите ткань в культуральную пластину, содержащую буфер.

Измельчите ткань и переложите ее в пробирку с папаином.

Папаин переваривает внеклеточный матрикс ткани, расслабляя клетки, в том числе нейроны.

Перенесите переваренную ткань в пробирку с белками BSA, останавливая ферментативную активность и предотвращая повреждение клеток.

Механически диссоциируют ткани, высвобождая клетки.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, содержащую мусор и ферменты.

Ресуспендируйте клетки в нейронных средах с низкой флуоресценцией и отфильтруйте через клеточный фильтр, удаляя клеточные агрегаты.

Выполните сортировку клеток, активируемых флуоресценцией, чтобы идентифицировать и отсортировать флуоресцентные нейроны.

Перенесите отсортированные нейроны в микроцентрифужную пробирку и центрифугу. Ресуспензируйте нейроны в нейронной среде.

Засейте нейроны на покровных стеклах, покрытых поли-L-лизином, в многолуночном планшете. Нейроны прилипают к покрытым поверхностям.

Добавьте нейронные среды. Инкубируйте для облегчения роста нейронов.

Сначала рассеките мозжечок и разделите два полушария. Затем аккуратно отделите гиппокамп и кору головного мозга от каждого полушария. Перенесите рассеченную ткань в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую охлажденный буфер для клеточных культур.

Затем перенесите рассеченный гиппокамп и кору головного мозга на крышку еще одной 35-миллиметровой чашки Петри. Используя плоский край лезвия скальпеля, осторожно разрежьте ткань крест-накрест до тех пор, пока не останутся только мелкие кусочки.

Далее переложите измельченную ткань с небольшим количеством раствора папаина из крышки чашки Петри в стерильную папаинскую трубку. Инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25 минут. После инкубации папаина перенесите стерильную трубку с папаином и стерильные трубки BSA в проточный шкаф. Затем с помощью пипетки Пастера объемом 1 миллилитр перенесите только кортико-гиппокампальную ткань из папаиновой трубки в трубку BSA 1.

Для того, чтобы разбить любые большие комки ткани, разотрите ткань несколько раз с помощью пипетки Пастера объемом 1 миллилитров. После этого растерите ткань семь раз с помощью пипетки Пастера с тонким наконечником. Через 30 секунд переведите 1 миллилитр нижнего раствора и ткани из пробирки БСА 1 в пробирку БСА 2.

Измельчите ткань в пробирке BSA 2 несколько раз с помощью пипетки Пастера с тонким наконечником. После растирания переведите 1 миллилитр нижних тканей в растворе из пробирки БСА 1 в пробирку БСА 3. Измельчите ткань в пробирке BSA 3 несколько раз.

После растирания переложите весь раствор и ткань из пробирок 2 и 3 в пробирку BSA 1. Растирать еще 2-3 раза и центрифугировать при 3 000 раз g в течение 3 минут. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость из гранулированной ткани и ресуспендируйте клетки с помощью пипетки P1000 в 2 миллилитрах полной среды Hibernate A с низкой флуоресценцией. Затем растирайте ткань 20 раз, чтобы обеспечить полную ресуспендию тканевого раствора.

Затем отфильтруйте клеточную суспензию через 30-микрометровое ячеистое сито в пробирку для образцов из полистирола. Подготовьте пробирки для сбора клеточной сортировки путем дозирования 300 микролитров полной среды гиберната А на необходимое количество полипропиленовых пробирок.

Для каждого типа флуоресцентных ячеек, подлежащих сортировке, выберите соответствующие фильтры возбуждения и излучения. Возбуждайте венозный белок с помощью волны возбуждения 488 нанометров и обнаруживайте излучаемый свет с помощью набора фильтров 530 over 40.

Возбуждайте белок TdTomato, используя длину волны возбуждения 531 наном, и обнаруживайте излучаемый свет с помощью набора фильтров 575 over 30. Для получения высокой чистоты сортируйте ярко помеченные флуоресцентные клетки. После сортировки клеток переложите собранные ячейки в 2-миллилитровые центрифужные пробирки с круглым дном. Затем центрифугируйте клетки при 3000 умноженных на g в течение 3 минут, чтобы сформировать клеточную гранулу.

Ресуспендируйте клеточную гранулу в необходимом количестве предварительно нагретой полной среды NBA для достижения плотности клеток 1000 клеток на микролитр. Чтобы подтвердить наличие диссоциированных клеток, проверьте клеточный раствор под микроскопом с помощью объектива с 4-кратным или 10-кратным увеличением. Перед нанесением покрытия на клетки сделайте вихрь на средней скорости в течение 2-3 секунд, чтобы обеспечить равномерную суспензию клеток.

После вортекса быстро пипеткой нанесите 10 микролитров клеточной суспензии в центр каждого покровного стекла. Через час накормите клетки 500 микролитрами предварительно подогретой полной среды NBA и верните в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия.