Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток в бессывороточных монослойных культурах

Начните с культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши.

Промойте клетки буфером, чтобы удалить среду и остатки клеток.

Добавьте коктейль ферментов, чтобы отделить клетки от поверхности колбы.

Добавьте среду, чтобы остановить ферментативную активность и соберите клетки в пробирку. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую ферменты.

Ресуспендируйте клетки в бессывороточных питательных средах нейронов.

Высадите клетки на многолуночные лунки, покрытые желатином.

инкубировать. Эмбриональные стволовые клетки прилипают к поверхности, покрытой желатином. Составляющие среды, включая питательные вещества, факторы роста и гормоны, способствуют пролиферации клеток и образуют монослой.

При такой плотности клеток эмбриональные стволовые клетки продуцируют и высвобождают оптимальные уровни факторов роста и цитокинов.

Эти молекулы запускают внутриклеточные сигнальные пути, способствуя дифференцировке эмбриональных стволовых клеток в нейральных предшественников.

Смешайте желатин с 500 миллилитрами теплого PBS и накройте дно контейнера для клеточных культур ровно настолько, чтобы поверхность была покрыта. Пока желатин покрывает его, промывайте субсливающуюся культуру эмбриональных стволовых клеток мыши два раза в PBS. Затем добавьте в культуру 1 миллилитр диссоциационного реагента.

Через две-пять минут постучите по сосуду, чтобы вытеснить монослой в одноклеточную суспензию и соберите культуру в общей сложности 10 миллилитров реагента для диссоциации среды и клеток.

Переложите клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку и раскрутите их в центрифуге. Затем, после тщательной аспирации надосадочной жидкости, повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах предварительно подогретого пипетом N2B27 к боковой стороне трубки во избежание образования пузырьков.

Теперь подсчитайте ячейки, регистрируя концентрацию, и повторно суспендируйте их в соответствующем количестве ячеек на единицу объема на лунку в предварительно нагретом N2B27 согласно таблице. Затем аспирируйте желатин из сосуда для культивирования и нанесите пластины на клетки, не закручивая контейнер.

Поместите культуры во влажный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, заменяя среду каждые один-два дня свежей N2B27.