Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток в бессывороточных монослойных культурах
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 2:41 мин • July 8th, 2025
Начните с культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши.
Промойте клетки буфером, чтобы удалить среду и остатки клеток.
Добавьте коктейль ферментов, чтобы отделить клетки от поверхности колбы.
Добавьте среду, чтобы остановить ферментативную активность и соберите клетки в пробирку. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую ферменты.
Ресуспендируйте клетки в бессывороточных питательных средах нейронов.
Высадите клетки на многолуночные лунки, покрытые желатином.
инкубировать. Эмбриональные стволовые клетки прилипают к поверхности, покрытой желатином. Составляющие среды, включая питательные вещества, факторы роста и гормоны, способствуют пролиферации клеток и образуют монослой.
При такой плотности клеток эмбриональные стволовые клетки продуцируют и высвобождают оптимальные уровни факторов роста и цитокинов.
Эти молекулы запускают внутриклеточные сигнальные пути, способствуя дифференцировке эмбриональных стволовых клеток в нейральных предшественников.
Смешайте желатин с 500 миллилитрами теплого PBS и накройте дно контейнера для клеточных культур ровно настолько, чтобы поверхность была покрыта. Пока желатин покрывает его, промывайте субсливающуюся культуру эмбриональных стволовых клеток мыши два раза в PBS. Затем добавьте в культуру 1 миллилитр диссоциационного реагента.
Через две-пять минут постучите по сосуду, чтобы вытеснить монослой в одноклеточную суспензию и соберите культуру в общей сложности 10 миллилитров реагента для диссоциации среды и клеток.
Переложите клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку и раскрутите их в центрифуге. Затем, после тщательной аспирации надосадочной жидкости, повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах предварительно подогретого пипетом N2B27 к боковой стороне трубки во избежание образования пузырьков.
Теперь подсчитайте ячейки, регистрируя концентрацию, и повторно суспендируйте их в соответствующем количестве ячеек на единицу объема на лунку в предварительно нагретом N2B27 согласно таблице. Затем аспирируйте желатин из сосуда для культивирования и нанесите пластины на клетки, не закручивая контейнер.
Поместите культуры во влажный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, заменяя среду каждые один-два дня свежей N2B27.
Обзор
В данной статье описывается процесс дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в нейральные предшественники. Протокол включает отделение клеток, их ресуспендирование и высев на поверхности, покрытые желатином, для обеспечения адгезии и роста.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
Обзор
- Эмбриональные стволовые клетки мыши могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Нейральные предшественники имеют важное значение для изучения развития нервной системы.
- Факторы роста и цитокины играют ключевую роль в дифференцировке клеток.
- Для оптимального роста клеток необходимы надлежащие условия культивирования.
Цель исследования
- Разработка надежного метода дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в нейральные предшественники.
- Оптимизация условий культивирования для пролиферации клеток.
- Изучение сигнальных путей, участвующих в процессе дифференцировки.
Используемые методы
- Культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши в контролируемой среде.
- Использование ферментного коктейля для открепления клеток.
- Ресуспендирование клеток в безсывороточной среде для нейрональных культур.
- Инкубация на планшетах, покрытых желатином, для обеспечения адгезии.
Основные результаты
- Успешное отделение и ресуспендирование эмбриональных стволовых клеток.
- Формирование монослоя клеток на поверхностях, покрытых желатином.
- Достигнуты оптимальные уровни факторов роста и цитокинов.
- Клетки дифференцировались в нейральные предшественники при заданных условиях.
Выводы
- Данный протокол эффективно дифференцирует эмбриональные стволовые клетки мыши в нейральные клетки-предшественники.
- Факторы роста и цитокины имеют решающее значение для успешной дифференцировки.
- В дальнейших исследованиях можно изучить возможности применения этих нейральных клеток-предшественников в научной работе.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание надежного метода получения нейральных предшественников из плюрипотентных стволовых клеток позволяет снизить риски при механистической валидации мишеней нейродегенеративных заболеваний. Этот бессывороточный монослойный подход повышает прогностическую достоверность за счет снижения биологической вариабельности в рабочих процессах на ранних этапах поиска. Данный метод представляет собой масштабируемую и воспроизводимую систему для анализа сигнальных путей и скрининга перспективных соединений при разработке препаратов для терапии заболеваний ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в путях нейроразвития с использованием определенной системы без сыворотки.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет стабильного получения нейральных предшественников из эмбриональных стволовых клеток.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем моделирования ранней нейральной дифференцировки в контролируемых условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получить гомогенную популяцию нейральных предшественников, подходящую для проведения скрининговых анализов соединений.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию анализа за счет использования монослойной культуры на поверхностях, покрытых желатином, с применением определенных сред.
- Масштабируемость: поддерживает форматы многолуночного посева для оценки соединений со средней и высокой пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает релевантную заболеванию систему для изучения механизмов нейроразвития перед валидацией in vivo.
- Механистическое снижение рисков: позволяет проводить исследования модуляции конкретных мишеней в путях в клеточном контексте, релевантном для человека.
- Прогностическая достоверность: обеспечивает получение показателей, согласованных с биомаркерами, для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки лекарств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, позволяя на ранних этапах оценивать влияние соединений на пути нейральной дифференцировки.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей при валидации нейроонтогенетических мишеней.
- Скрининг: позволяет получать готовых к анализу нейральных предшественников с воспроизводимой адгезией и пролиферацией на покрытых субстратах.
- Аналитика: обеспечивает количественную оценку эффективности дифференцировки и экспрессии маркеров для скрининга соединений.
- Трансляционные исследования: связывает ранние этапы открытий с доклинической преемственностью посредством определенной модели нейральных предшественников.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для валидации мишеней ЦНС в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения неопределенности механизмов нейрональной дифференцировки.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным бессывороточным условиям и покрытию желатином.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет возможности ранней оценки влияния соединений на определение нейрональной линии.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию мишеней ЦНС с учетом рисков благодаря использованию надежных, проверенных доклинических моделей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток и методами нейральной дифференцировки.
- Результат зависит от стабильного качества покрытия желатином и приготовления безсывороточной среды N2B27.
- Необходимо соблюдение стандартизированной плотности посева клеток для запуска автокринной сигнализации.
- Процесс включает регулярную смену среды и мониторинг формирования монослоя и дифференцировки.
- Метод ограничен эмбриональными стволовыми клетками мыши; адаптация для других видов требует валидации.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы
Похожие видео
0 Просмотры
Перезапуск нейронных цепей: новый метод быстрого наращивания нейритов и функционального нейронного соединения
Похожие видео
0 Просмотры
Нейрональная дифференциация от мыши эмбриональных стволовых клеток in vitro
Похожие видео
0 Просмотры
Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула
Похожие видео
0 Просмотры
Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде
Похожие видео
0 Просмотры
Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в нейронных предшественников
Похожие видео
0 Просмотры
Получение шванновских клеток, подобных клеткам, из стромальных клеток костного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Генерация предшественников корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши методом висячей капли
Похожие видео
0 Просмотры
Методика получения нейральных клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026