Дифференцировка нейронных стволовых клеток человека в 3D-культуру с использованием пористого каркаса

Начните с многолуночной пластины, содержащей пористую вставку, которая удерживает полистирольный каркас, обладающий трехмерной пористой структурой.

Добавьте этанол, чтобы увлажнить каркас, и промойте его этим средством.

Ввести среду, содержащую белок внеклеточного матрикса, ламинин. Инкубируйте, чтобы ламинин покрыл каркас.

Посадите нервные стволовые клетки человека в нейронную среду, содержащую факторы роста, на каркас, покрытый ламинином.

Инкубируйте для миграции стволовых клеток в пористый каркас, где ламинин способствует адгезии клеток к каркасу.

Клетки используют факторы роста и размножаются в этом каркасе.

Добавьте нейронную среду без фактора роста и регулярно заменяйте отработанную среду для поддержания жизнеспособности клеток.

Отсутствие факторов роста стимулирует дифференцировку стволовых клеток в нейральные клетки-предшественники.

Со временем нервные отростки этих клеток-предшественников удлиняются, что позволяет вести разнонаправленный рост клеток и формировать трехмерную культуру.

Регидратируйте каркасы, добавив в каждую лунку 12-луночной пластины Альветэкс по 2 миллилитра 70% этанола, приготовленного с использованием воды для полива. Избегайте прикосновения к каркасам, выдавая 70% этанол по стенке каждого колодца. Тщательно отасуньте 70% этанол и немедленно промойте скаффолды 2 миллилитрами на лунку DMEM F12 в течение одной минуты.

Повторите процедуру стирки дважды. Осторожно отсасывайте DMEM F12 после окончательной промывки. Покройте скаффолды, добавив в каждую лунку по 2 миллилитра ламинина в DMEM F12. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, увлажненном углекислым газом с 5% содержанием углекислого газа, в течение как минимум двух часов.

Далее вымойте тарелку теплым DMEM F12. Засейте каждый каркас примерно 500 000 нервных стволовых клеток человека или HNSC в объеме 150 микролитров среды RMM с факторами роста. Инкубируйте планшет в течение трех часов, чтобы клетки могли осесть в каркасах.

Через три часа добавьте по 3,5 миллилитра RMM в каждую лунку, стараясь не выбить клетки из каркасов. Выдерживайте тарелку в течение семи или 21 дня. Замените среду через один день, который является первым кормлением, и снова замените среду через 2-3 дня после первого кормления.