Генерация постганглионарных симпатических нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека

Возьмите микропланшет, покрытый внеклеточным матриксом, и добавьте человеческие плюрипотентные стволовые клетки, суспензированные в среде для дифференцировки.

Среда содержит сигнальные молекулы, которые влияют на клеточные сигнальные пути, направляя дифференцировку в нейронные клетки-предшественники.

Введите другую среду для дифференцировки, содержащую сигнальные молекулы, которые индуцируют дифференцировку в клетки нервного гребня, или НКК, предшественники нейрональных и ненейрональных клеток.

Добавляйте ферменты, чтобы нарушить работу матрицы, тем самым диссоциировав клетки.

Промойте для нейтрализации ферментов, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте НКЦ в среде сфероидов и перенесите их на микропланшет.

Факторы роста и малые молекулы среды вызывают образование сфероидов.

Добавка с ретиноевой кислотой, которая способствует дифференцировке в симпатические прогениторные нейроны.

Перенесите сфероид на микропланшет, покрытый белками адгезии, в среду созревания симпатических нейронов, вызывая прикрепление сфероида.

Нервные факторы роста и ретиноевая кислота в среде способствуют созреванию в постганглионарные симпатические нейроны, которые входят в состав периферической нервной системы и регулируют непроизвольные процессы.

За день до индукции дифференцировки покройте соответствующее количество шестилуночных планшетов двумя миллилитрами матрицы базальной мембраны на лунку и храните планшеты при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующее утро нагрейте планшеты до комнатной температуры и промойте готовую к расщеплению культуру плюрипотентных стволовых клеток человека два раза свежим PBS за одну промывку.

После второй промывки обрабатывайте клетки семью миллилитрами 0,5 миллимолярной ЭДТА в течение 15 минут в инкубаторе для клеточных культур, прежде чем аспирировать плавающие плюрипотентные стволовые клетки человека и перенести собранные клетки в 50-миллилитровую пробирку.

Добавьте равный объем PBS в пробирку, чтобы разбавить ЭДТА, и соберите клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре суспендирования 01 сутки дифференцировочной среды. Перед добавлением соответствующего объема среды для подсчета разбавьте клетки до концентрации 1,25 х 10⁵ клеток на квадратный сантиметр в двух миллилитрах дифференцировочной среды на лунку.

Аспирируйте весь матричный раствор базальной мембраны из каждой лунки предварительно подготовленного шестилуночного планшета. Затем засейте по 2 миллилитра клеток в каждую лунку и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. На следующее утро подкормите клетки 3 миллилитрами среды для дифференцировки Day 01 на лунку.

На второй день дифференцировки подкормите клетки тремя миллилитрами среды для дифференцировки со второго по десятый день на лунку. Затем подкармливайте клетки через день до 10 дня. Чтобы агрегировать клетки нервного гребня в сфероиды, на 10-й день промойте клетки PBS и добавьте в каждую лунку по два миллилитра диссоциативной среды. Через 20 минут в инкубаторе для клеточных культур переложите плавающие клетки в 50-миллилитровую коническую пробирку, и доведите объем суспензии в пробирке до 50 миллилитров с помощью свежего PBS.

Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в достаточном объеме на 10-14 сутки в сфероидальной среде для подсчета. После подсчета разбавьте клетки до концентрации 5 x 10⁵ клеток на 500 микролитров, используя сфероидную среду с 10 по 14 день, и поместите 500 микролитров клеток в каждую лунку 24-луночного планшета со сверхнизким присоединением. Затем верните клетки в инкубатор для клеточных культур.

Чтобы индуцировать минимальную культуру сфероидов, на 11-й день культивирования скармливайте сфероидам нервного гребня дополнительно 500 микролитров сфероидной среды на 10-14 день на лунку. На 12-й день наклоните пластину, чтобы накопить сфероиды на одной стороне пластины, и осторожно отсасывайте как можно больше среды из каждой лунки, не отсасывая сфероиды. Затем скармливайте сфероидам по одному миллилитру в день от 10 до 14 сфероидов среды на лунку.

Для индуцирования расширенной культуры сфероидов на 15-е сутки скармливайте сфероидам по 1,5 мл сфероидной среды с 10 по 14 день с добавлением 0,5 микромольной ретиноевой кислоты на лунку. Затем верните сфероиды в инкубатор для клеточных культур.

Для дифференцировки симпатических нейронов на 14 или 28 день наклоните пластину, чтобы накопить сфероиды на одной стороне пластины, и осторожно аспирируйте как можно больше среды. Накормите клетки одним миллилитром среды симпатических нейронов.

Чтобы разбить большие сфероидальные агрегаты на более мелкие сфероиды, добавьте не более одного миллилитра среды в лунку и пипетируйте сфероиды от пяти до 10 раз перед расщеплением.

И удалите излишки ламинина фибронектина из заранее подготовленных 24-луночных планшетов. Разделите планшет с одним миллилитром сфероидов из каждой лунки на 24-луночном планшете для культивирования сфероидов между четырьмя отдельными лунками только что покрытого 24-луночного планшета. Добавьте в каждую лунку по 250 микролитров свежей среды симпатических нейронов и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. На следующее утро замените среду в каждой лунке одним миллилитром среды симпатических нейронов с добавлением 0,125 микромолярной ретиноевой кислоты и верните планшет в инкубатор для клеточных культур. После 35-го дня подкармливайте нейроны, осторожно заменяя только половину имеющейся среды в каждой лунке свежей средой.