Генерация и дифференцировка первичных нейросфер из нейр-стволовых клеток рыбок данио

Начните с многолуночного планшета, содержащего питательную среду, обогащенную факторами роста.

Засейте одноклеточную суспензию нейр-стволовых клеток рыбок данио и инкубируйте.

Первоначально стволовые клетки используют факторы роста и размножаются.

Удалите мусор и добавьте свежую среду, чтобы способствовать непрерывной пролиферации клеток и спонтанной агрегации с образованием свободно плавающих первичных нейросфер.

Затем перенесите нейросферы в свежую лунку, содержащую питательную среду.

Инкубируйте в тех же условиях, чтобы вызвать прогрессивное расширение нейросфер.

Повторяйте пипетку, чтобы механически диссоциировать нейросферы на небольшие кластеры.

Затем перенесите их на внеклеточный матрикс, хорошо покрытый покрытием, облегчающий их адгезию.

Замените питательную среду средой для дифференцировки без фактора роста, содержащей инсулин.

Отсутствие факторов роста и наличие инсулина стимулируют дифференцировку клеток в глиальные клетки и нейроны с нейрональными проекциями.

Чтобы подготовиться к генерации нейросферы, заполните каждую лунку 24-луночного планшета 300 микролитрами свежей Z-кондиционной среды. Затем добавьте по 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, засев их