Метод ко-культивирования для дифференцировки нейронных клеток-предшественников человека в нейроны

Возьмем культуру человеческих нейронных клеток-предшественников, или NPC, поддерживаемых на внеклеточном матриксе.

NPC спроектированы таким образом, чтобы экспрессировать флуоресцентный белок.

Выбросьте среду и промойте ячейки, чтобы удалить остатки среды.

Инкубируйте культуру с ферментами, которые нарушают работу матрикса, диссоциируя клетки.

Переложите отделенные клетки в пробирку и добавьте среду для нейтрализации ферментативного действия.

Центрифуга для гранулирования клеток, отбрасывания надосадочной жидкости и ресуспендирования NPC в среде для дифференцировки нейронов.

Перенесите NPC в устоявшуюся совместную культуру мышиных астроцитов и нейронов коры головного мозга крысы.

Факторы роста, высвобождаемые созданной кокультурой, наряду с межклеточными контактами NPC с корковыми нейронами и астроцитами, способствуют дифференцировке NPC в зрелые нейроны.

Зрелые нейроны демонстрируют расширенные клеточные процессы и образуют синаптические связи.

Под конфокальным микроскопом используйте сигнал от флуоресцентных белков для визуализации нейронов, полученных от NPC человека.

После создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или ИПСК индуцируйте и поддерживайте клетки в качестве нейронной клетки-предшественника человека или культуры NPC в соответствии с текстовым протоколом. В этом примере NPC помечены с помощью лентивирусного вектора Synapsin1-tdTomato. На следующий день после добавления первичных нейронов в культуру астроцитов используйте 1X PBS для однократного мытья человеческих NPC. Затем добавьте раствор для отслойки клеток и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Убедитесь, что все клетки отделились, затем перенесите их в 15-миллилитровую пробирку, содержащую в два раза больше DMEM/F12, и центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и используйте среду для дифференцировки нейронов, чтобы мягко ресуспендировать гранулу в отдельные клетки. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.

Далее осторожно отсасывайте среду из культур кортикальных нейронов астроцитов. Поместите человеческие NPC в дозу 5000 клеток на квадратный сантиметр на лунку в среде для дифференцировки нейронов. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5%_CO2 и заменяйте среду каждые два-три дня в течение не менее 28 дней.

Чтобы подтвердить, ведут ли себя человеческие ИПСК как зрелые нейроны, используйте конфокальный микроскоп, оснащенный 60-кратной линзой погружения в воду. Найти клетки, дифференцированные от человеческих iPSCs, с помощью визуализации tdTomato.