JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:14 мин • July 8th, 2025
Возьмем культуру человеческих нейронных клеток-предшественников, или NPC, поддерживаемых на внеклеточном матриксе.
NPC спроектированы таким образом, чтобы экспрессировать флуоресцентный белок.
Выбросьте среду и промойте ячейки, чтобы удалить остатки среды.
Инкубируйте культуру с ферментами, которые нарушают работу матрикса, диссоциируя клетки.
Переложите отделенные клетки в пробирку и добавьте среду для нейтрализации ферментативного действия.
Центрифуга для гранулирования клеток, отбрасывания надосадочной жидкости и ресуспендирования NPC в среде для дифференцировки нейронов.
Перенесите NPC в устоявшуюся совместную культуру мышиных астроцитов и нейронов коры головного мозга крысы.
Факторы роста, высвобождаемые созданной кокультурой, наряду с межклеточными контактами NPC с корковыми нейронами и астроцитами, способствуют дифференцировке NPC в зрелые нейроны.
Зрелые нейроны демонстрируют расширенные клеточные процессы и образуют синаптические связи.
Под конфокальным микроскопом используйте сигнал от флуоресцентных белков для визуализации нейронов, полученных от NPC человека.
После создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или ИПСК индуцируйте и поддерживайте клетки в качестве нейронной клетки-предшественника человека или культуры NPC в соответствии с текстовым протоколом. В этом примере NPC помечены с помощью лентивирусного вектора Synapsin1-tdTomato. На следующий день после добавления первичных нейронов в культуру астроцитов используйте 1X PBS для однократного мытья человеческих NPC. Затем добавьте раствор для отслойки клеток и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Убедитесь, что все клетки отделились, затем перенесите их в 15-миллилитровую пробирку, содержащую в два раза больше DMEM/F12, и центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и используйте среду для дифференцировки нейронов, чтобы мягко ресуспендировать гранулу в отдельные клетки. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.
Далее осторожно отсасывайте среду из культур кортикальных нейронов астроцитов. Поместите человеческие NPC в дозу 5000 клеток на квадратный сантиметр на лунку в среде для дифференцировки нейронов. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5%CO2 и заменяйте среду каждые два-три дня в течение не менее 28 дней.
Чтобы подтвердить, ведут ли себя человеческие ИПСК как зрелые нейроны, используйте конфокальный микроскоп, оснащенный 60-кратной линзой погружения в воду. Найти клетки, дифференцированные от человеческих iPSCs, с помощью визуализации tdTomato.
В данной статье описывается протокол дифференцировки нейральных стволовых клеток (НСК) человека в зрелые нейроны с использованием системы кокультивирования с астроцитами мыши и кортикальными нейронами крысы. НСК модифицированы для экспрессии флуоресцентного белка с целью визуализации с помощью конфокального микроскопа.
Дифференцировка человеческих нейральных стволовых клеток в функциональные нейроны является критически важным этапом валидации мишеней для моделей нейродегенеративных заболеваний. Данный метод совместного культивирования повышает прогностическую достоверность, обеспечивая релевантную заболеванию систему, которая позволяет снизить риски при проверке механистических терапевтических гипотез. Такой подход обеспечивает масштабируемую подготовку валидированных нейрональных фенотипов для последующей разработки методов анализа и проведения скрининговых кампаний.
Данный метод вписывается в континуум исследований — от получения NPC из стволовых клеток до функциональных нейрональных анализов, что способствует поиску перспективных соединений путем фенотипического скрининга их влияния на созревание и связность.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026