Метод непрямого сокультивирования нейронов и астроцитов для изучения взаимодействий нейронов и глии

Начните с многолуночного планшета, содержащего проницаемую мембранную вставку, покрытую поли-D-лизином.

Добавьте в лунку среду для роста астроцитов и затравите во вкладыш астроциты, специализированные глиальные клетки.

Инкубируйте для обеспечения адгезии клеток на поли-D-лизине посредством электростатических взаимодействий и формирования монослоя.

Замените астроцитарную среду средой для культивирования нейронов.

Перенесите эту вставку в многолуночный планшет, содержащий прилипшие первичные эмбриональные нейроны мыши, поверх покровного стекла с полимерным покрытием.

Инкубируйте для создания непрямой культуры нейронов и астроцитов, в которой два типа клеток физически разделены, но используют одну и ту же питательную среду.

Астроциты выделяют различные нейротрофические факторы, необходимые для выживания и роста нейронов.

Эти факторы мигрируют через проницаемую опору и взаимодействуют с первичными нейронами. Это способствует их дифференцировке и формирует нейронные проекции.

Эти проекции удлиняются и устанавливают синаптические связи между нейронами, указывая на нейрон-глиальные взаимодействия.

Посыпьте каждую вставку 10 микрограммами на миллилитр поли-D-лизина и инкубируйте в течение часа. Через час дважды промойте вкладыши PBS.

Тем временем аспирируйте астроцитарную среду и промойте культуру один раз 10 миллилитрами PBS, чтобы убедиться, что остатки сыворотки удалены. Далее добавьте в колбы 3 миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА, и инкубируйте клетки для трипсинизации примерно 10 минут. После этого аккуратно ресуспендируйте клетки в 7 миллилитрах астроцитарной среды.

Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте в течение пяти минут при 216-кратном изг. Затем осторожно отасуньте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 миллилитр астроцитарной среды. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры. Затем заполните 24-луночный планшет 500 микролитрами астроцитарной среды на лунку. Аспирируйте PBS и перенесите 25 000 клеток в 500 микролитров астроцитарной среды в каждую отдельную вставку, а затем инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия.

Чтобы препарировать гиппокамп, приготовьте три 10-сантиметровые посуды, наполненные подготовительной средой, и одну 2-миллилитровую трубку с 1 миллилитром подготовительной среды. Отделите гиппокампы от фрагментов коры головного мозга и соберите их в 2-миллилитровую пробирку, наполненную подготовительной средой.

Крайне важно, чтобы гиппокамп был изолирован без каких-либо прилегающих тканей от других областей ЦНС. Поэтому после удаления гиппокампа инородные загрязняющие ткани должны быть дополнительно удалены.

После вскрытия перенесите трубку на стерильный стенд для ламинарного потока. Тщательно удалите подготовительную среду, и расплодите ткани гиппокампа с 1 миллилитром раствора для дигезирования, содержащего папаин. После 15 минут вываривания осторожно выведите раствор для вареживания путем легкого отсасывания с помощью пипетки.

Из-за высокой чувствительности нейрона крайне важно осторожно растирать гиппокамп, чтобы избежать образования пузырьков и получить оптимальную интенсивность растирания.

Трижды промойте гиппокамп средой нейронов, добавив и тщательно отасунув 1 миллилитр свежей питательной среды за цикл мытья. После заключительного этапа промывки тщательно разотрите ткань в 1 миллилитре нейронной среды. Затем подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры. Поместите 35 000 клеток в 500 микролитров нейронной среды в лунку 24-луночного планшета и инкубируйте нейроны при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Теперь выньте из инкубатора подготовленные вкладыши, которые были засеяны сливающимися монослоями астроцитов. Замените среду путем аспирации астроцитарной среды и замены ее 500 микролитрами свежей нейронной среды.

Затем осторожно поместите вкладыши с астроцитами в лунки, которые содержат культуры нейронов, с помощью стерильных щипцов. Впоследствии поместите полученную кокультуру непрямых нейронов астроцитов обратно в инкубатор до проведения экспериментов.