Простой метод выделения и культивирования мышиных астроцитов

Разрежьте кору головного мозга мыши на мелкие кусочки и переложите в холодную среду для препарирования, содержащую буферизованный раствор соли.

Добавьте пищеварительные ферменты для диссоциации внеклеточного матрикса.

Чтобы удалить остатки ферментов, промойте холодной средой для рассечения.

Замените эту среду средой, обогащенной астроцитами.

Далее с помощью пипетки диссоциируйте кусочки ткани.

Пропустите суспензию через ситечко, чтобы удалить недиссоциированную ткань и получить одиночные клетки.

Перенесите элементы на положительно заряженную пластину с полимерным покрытием. Инкубировать с встряхиванием.

Астроциты прочно прилипают, в то время как слабо связанные нейроны, микроглия и олигодендроциты отделяются.

Обогащающая среда превращает зрелые астроциты в делящиеся полигональные астроциты.

Удалите оторвавшиеся клетки и промойте астроциты фосфатным буфером.

Добавьте пищеварительные ферменты для отделения астроцитов.

Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить ферментативную активность. Соберите астроциты в пробирку и центрифугу.

Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в среде созревания астроцитов для поддержания типичной звездообразной зрелой структуры астроцитов.

Разрежьте любую кортикальную ткань, которая будет использоваться для генерации астроцитов, на кусочки размером не более 1 кубического миллиметра. Как только все кусочки ткани будут собраны, подождите, пока они осядут на дно трубки. Затем аспирируйте как можно больше среды. После этого добавьте от 2 до 3 миллилитров 0,05% трипсина ЭДТА и инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

После этого осторожно отсасывайте трипсин ЭДТА, оставляя кусочки ткани в минимальном количестве жидкости на дне трубки. Далее добавьте 5 миллилитров предварительно охлажденной среды для вскрытия, чтобы смыть остатки трипсина ЭДТА, и сделайте пипетку сбоку от верхней пробирки, чтобы добиться перемешивания кусочков ткани. Затем аспирируйте диссекционную среду и оставьте кусочки ткани в как можно меньшем количестве жидкости.

Повторите этот этап промывки с предварительно охлажденной средой для рассечения дважды. После заключительного этапа промывки добавьте 1 миллилитр DMEM PLUS комнатной температуры и титруйте ткань пипетированием вверх и вниз без введения пузырьков.

Астроциты довольно чувствительны к pH, поэтому важно избегать образования пузырьков, так как это может изменить pH раствора.

Далее поместите 100-микронный сетчатый фильтр в отверстие 50-миллилитровой трубки и предварительно смочите фильтр 4,5 миллилитрами предварительно охлажденного DMEM PLUS. Пипеткой нанесите 1 миллилитр диссоциированной тканевой суспензии на клеточный фильтр, и добавьте еще 4,5 миллилитра предварительно охлажденного DMEM PLUS, чтобы промыть клетки через него. На 7-й день in vitro после вскрытия поместите 10-сантиметровые чашки с клетками в DMEM PLUS на шейкер в инкубаторе и встряхивайте чашки при 110 об/мин в течение шести часов.

За 20-30 минут до окончания шестичасового встряхивания предварительно разогрейте на водяной бане 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H и 0,25% трипсина ЭДТА до 37 градусов. После шести часов встряхивания снимите посуду с культурой из шейкера и немедленно замените среду 10 миллилитрами предварительно подогретого 1X PBS на блюдо. Впоследствии удалите PBS и добавьте 3 миллилитра предварительно подогретого трипсина ЭДТА на блюдо.

Затем инкубируйте образцы в течение четырех минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее добавьте в каждую посуду по 5 миллилитров предварительно подогретого DMEM PLUS к 3 миллилитрам трипсина ЭДТА. Пипеткой отньте клетки от чашки и соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку. После этого центрифугируйте клеточную суспензию при 3220 умноженных на g при 20 градусах Цельсия в течение четырех минут. Затем удалите надосадочную жидкость, после чего повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 миллилитре предварительно подогретого NB+H.