Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в нейроны на микроэлектродных матрицах

Возьмем, к примеру, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки или ИПСК, сверхэкспрессирующие нейрогенин-2, управляемые системой индуцирования антибиотика доксициклином.

Перенесите их на участки активных электродов, покрытых белком адгезии, в лунках многолуночной микроэлектродной матрицы.

Дайте ИПСК прикрепиться к областям активных электродов с покрытием.

Добавьте среду с добавлением доксициклина, который индуцирует сверхэкспрессию нейрогенина-2, нейроспецифического фактора транскрипции.

Нейрогенин-2 запускает молекулярные пути и приводит к дифференцировке иПСК в клетки-предшественники нервов, в то время как составляющие среды способствуют выживанию клеток.

Введите астроциты в лунки микроэлектродной матрицы, где они прилипают к активной зоне электрода.

Замените среды нейробазальными средами, содержащими нейрогенные факторы роста, доксициклин и ингибитор роста клеток.

Ингибитор предотвращает пролиферацию астроцитов и устраняет недифференцированные ИПСК

Со временем устойчивая экспрессия нейрогенина-2 и факторы роста стимулируют дифференцировку клеток-предшественников нейронов в нейроны.

Кроме того, замените среды нейробазальными средами, содержащими сыворотку для выживания астроцитов.

Астроциты выделяют факторы роста, способствующие созреванию нейронов и образованию синапсов, формируя нейронную сеть.

Для шестилуночных МЭА разбавьте клетки до получения клеточной суспензии 7,5 х 10⁵ клеток на миллилитр. Аспирируйте разведенный ламинин из шестилуночных МЭА. Для шестилуночных МЭА пластинируйте ячейки, добавив 100 микролитров суспензии к активной области электродов в каждой лунке.

Затем поместите шестилуночные MEA во увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Через два часа осторожно добавьте по 500 микролитров подготовленной среды Е8 в каждую лунку из шестилуночных МЭА. Затем поместите шестилуночные МЭА на ночь в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия.

На третий день подогрейте 0,05% Trypsin-EDTA до комнатной температуры. Подогреть DPBS в DMEM/F-12 с 1% пенициллин-стрептомицином до 37 градусов Цельсия. Затем аспирируйте отработанную среду культуры астроцитов крысы. Промойте культуру, добавив 5 миллилитров DPBS, и аккуратно прополощите ее.

После этого аспирируйте DPBS и добавьте 5 миллилитров 0,05% трипсина-ЭДТА. Осторожно пополощите Trypsin-EDTA. Затем инкубируйте клетки во влажном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 5-10 минут. Впоследствии проверьте под микроскопом, чтобы рассмотреть, не оторвались ли клетки.

Отделите последние ячейки, ударив по колбе несколько раз. Затем добавьте в колбу 5 миллилитров DMEM/F-12. Аккуратно растирайте клетки внутри колбы с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. После этого соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку. Вращайте трубку при 200 умноженных на g в течение восьми минут.

После этого аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 миллилитре DMEM/F-12. Определяют количество клеток на миллилитр с помощью гемоцитометра.

Затем добавьте 7,5 x 10⁴ астроцита в каждую лунку из шести лунок MEA и добавьте 2 x 10⁴ астроцита в каждую лунку 24-луночного планшета. Инкубируйте клетки на ночь в увлажненном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия.