Развитие кокультуры нейронов и макрофагов in vitro

Начните с изолированных нейронов ганглия дорсального корешка мыши в питательной среде.

Посадите их на многолуночную пластину с полимерным покрытием, чтобы способствовать прикреплению нейронов.

Затем возьмите вскрытую усыпленную мышь и введите ледяной PBS в ее брюшную полость.

Мягко массируйте брюшину, чтобы вытеснить макрофаги со стенки брюшины.

Сожмите мышь, чтобы собрать перитонеальную жидкость и обработайте ее буфером для лизиса, чтобы избирательно лизировать эритроциты, которые проявляются как загрязнители. Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в питательной среде.

Перенесите макрофаги в пористую вставку, расположенную внутри лунки, содержащей культивируемые нейроны.

Такое совместное культивирование позволяет нейронам и макрофагам находиться в непосредственной близости.

Обработайте ко-культуру db-cAMP и инкубируйте для облегчения его проникновения в клетки. Это активирует нейроны для секреции сигнальных молекул.

Эти сигнальные молекулы, наряду с db-cAMP, побуждают макрофаги принимать прорегенеративный фенотип и секретировать важные факторы для роста нейронов.

Перед установкой культуры предварительно покройте 6-луночный планшет поли-D-лизином и ламинином. Затем инкубируйте 6-луночный планшет с 0,01 поли-D-лизином при 37 градусах Цельсия в течение двух часов или при 4 градусах Цельсия на ночь. После этого дважды промойте тарелку дистиллированной водой.

Затем инкубируйте тарелку с раствором ламинина в концентрации 3 микрограмма на миллилитр в течение двух часов при комнатной температуре. После этого дважды промойте тарелку дистиллированной водой и высушите тарелку при комнатной температуре не менее одного часа.

Теперь разрежьте кожу, лежащую над позвоночным столбом усыпленной мыши, хирургическим лезвием и рассеките паравертебральные мышцы с обеих сторон, чтобы обнажить позвоночные кости. Тщательно удалите кости позвонков с помощью хирургического наконечника с узким концом до тех пор, пока DRG не будут полностью обнажены.

Под препарирующим микроскопом удалите DRG двусторонне от S1 до уровня C1 с помощью иридэктомических ножниц и щипцов с тонкими наконечниками. Перенесите DRG в 1,5-миллилитровую пробирку Eppendorf с помощью синего наконечника для пипетки с отрезанным концом.

Затем извлеките DMEM после быстрого отжима в течение нескольких секунд с помощью мини-центрифуги. Добавьте 1 миллилитр DMEM, содержащего 125 единиц коллагеназы 11-го типа на миллилитр, и инкубируйте пробирку в течение 90 минут с легким вращением с помощью скрутки или шейкера при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого выбросьте коллагеназу, содержащую DMEM, и добавьте 1 миллилитр свежего DMEM. Перенесите DRG в коническую пробирку объемом 15 миллилитров с помощью синего наконечника для пипетки с отрезанным концом. Затем осторожно проводите пипеткой вверх и вниз, не менее 15 раз, чтобы получилась однородная клеточная суспензия.

Центрифугируйте пробирку при 239 г в течение трех минут и осторожно выбросьте надосадочную жидкость с плавающим мусором. Добавьте 1 миллилитр нейробазальной среды с добавлением B27 и повторно суспендируйте клеточную гранулу, осторожно пипетируя вверх и вниз от пяти до 10 раз.

Затем пропустите клеточную суспензию через 70-микрометровое клеточное ситечко, наложенное поверх 50-миллилитровой конической трубки. Затем поместите все собранные нейроны DRG в две лунки 6-луночного планшета.

Чтобы получить первичные перитонеальные макрофаги от взрослой мыши, аккуратно надрежьте кожу брюшной полости, чтобы обнажить брюшину, и избегайте разреза брюшины, чтобы предотвратить утечку жидкости для промывания.

Далее проколите брюшину с помощью шприца иглой 22 калибра и введите в брюшную полость 10 миллилитров ледяного PBS. Аккуратно массируйте брюшину в течение одной-двух минут. Затем вытащите иглу и выдавите PBS через место прокола иглой, а жидкость для промывания соберите в 50-миллилитровую коническую трубку.

После этого центрифугируйте жидкость для промывания при плотности 239 г в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы гранулировать клеточные компоненты. Затем повторно суспендируйте гранулу с 3 миллилитрами буфера для лизиса эритроцитов на три минуты при комнатной температуре.

Затем снова центрифугируйте клеточную суспензию при 239 g в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулированные клетки в 1 миллилитре нейробазальной среды B27. Пластину половины всех собранных макрофагов помещают на клеточную культуральную вставку с эффективной площадью 4,2 сантиметра в квадрате, которая размещается сверху лунки диссоциированных DRG.

Через четыре часа после того, как макрофаги нейронов были совместно культивированы, добавьте 2 микролитра 100-микролярного db-циклического раствора АМФ к совместным культурам макрофагов нейронов. Через 24 часа заполните пустую лунку 1 миллилитром питательной среды макрофагов в той же 6-луночной тарелке.

Перенесите вставку с клеточной культурой в кокультуре макрофагов нейрона в пустую лунку с питательной средой для макрофагов.