Отслеживание аксонального транспорта органелл в мотонейронах с помощью микрофлюидного устройства

Начните с микрофлюидной камеры с полимерным покрытием и проксимальными и дистальными лунками, соединенными несколькими микроканавками.

В проксимальном колодце поместите эмбриональные ткани спинного мозга мыши, богатые развивающимися двигательными нейронами.

Хорошо дополните это питательной средой. Инкубируйте для обеспечения роста нейронов и прилегания к поверхности с полимерным покрытием.

Позже добавьте питательную среду без фактора роста в проксимальную лунку.

В дистальные лунки добавьте больший объем питательной среды, содержащей факторы роста, чтобы создать разницу в концентрации и объеме.

Эти различия приводят к тому, что аксоны, более длинные нейронные проекции, растут к дистальным углублениям через микробороздки.

Добавьте раствор флуоресцентного красителя в обе лунки.

Молекулы красителя проникают в нейроны и окрашивают митохондрии и кислотные органеллы на обоих концах.

При конфокальной визуализации в реальном времени флуоресцентно окрашенные органеллы движутся в обоих направлениях между телами нервных клеток и аксонами, подтверждая транспорт аксонов в моторных нейронах.

Утилизируйте всю среду из проксимального отсека MFC. Возьмите пипеткой один эксплант спинного мозга общим объемом четыре микролитра и введите его как можно ближе к пещере. Вытяните лишнюю жидкость из проксимальной лунки через боковые выпускные отверстия. Повторите предыдущий шаг еще два раза, и убедитесь, что экспланты внедрены в проксимальный канал. Медленно добавьте 150 микролитров среды SCEX в проксимальную лунку.

Через день после нанесения покрытия замените среду SCEX в проксимальном отделе и добавьте богатую среду SCEX в дистальный отдел, поддерживая объемный градиент не менее 15 микролитров на лунку между дистальным и проксимальным углублениями. Через четыре-шесть дней аксоны должны перейти в дистальный отдел и быть готовыми к визуализации транспорта аксонов.

Чтобы пометить митохондрии и кислотные компартменты, приготовьте свежую среду SCEX со 100-наномолярным Mitotracker deep red FM и 100 наномоляром LysoTracker красным и добавьте ее в микрофлюидные камеры. Выдержите их от 30 до 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия, затем трижды промойте теплой средой SCEX. Продолжайте визуализацию аксонального транспорта в реальном времени, получая серию изображений из 100 интервалов в 3 секунды с общей продолжительностью 5 минут на фильм.