Выделение и бактериологическое исследование первичных нейронов и глии из мочевого пузыря крысы

Возьмем усыпленную крысу.

Вскройте брюшную полость, иссеките мочевой пузырь и погрузите его в буфер.

Разрежьте мочевой пузырь и удалите прилипший жир и остатки тканей.

Переложите мочевой пузырь в пробирку, содержащую буфер, центрифугу и удалите мусор.

Поместите ткань в раствор, содержащий коллагеназу, и пропустите через мясорубку. Добавьте больше коллагеназы, чтобы разрушить внеклеточный матрикс, разрыхляя клетки.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте трипсин, чтобы нарушить межклеточные соединения, высвобождая клетки.

Добавьте промывочную среду, содержащую белки, чтобы инактивировать трипсин, затем центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в среде, отфильтруйте их, чтобы удалить агрегаты, и получите одноклеточную суспензию.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в среде.

Наклейте клетки на покрытые покровные стекла, чтобы облегчить прикрепление нейронных и глиальных клеток. Удалите неприкрепленные ячейки.

Добавьте нейронную среду, содержащую факторы роста, чтобы способствовать клеточному созреванию, создавая первичную нейрональную и глиальную культуру.

Начните с того, что поместите крыс на стерилизованное хирургическое полотенце и обнажите брюшную полость. С помощью ножниц и щипцов вскройте брюшную полость и обнажите мочевой пузырь. С помощью другого набора ножниц и щипцов аккуратно приподнимите мочевой пузырь и отрежьте его от шейки мочевого пузыря.

Затем быстро поместите мочевой пузырь в холодный, устойчивый к кислороду раствор Кребса, чтобы улучшить выживаемость клеток. Добавьте раствор Кребса в три стеклянные посуды и три стеклянных стакана и поместите их на ледяную баню для предварительного охлаждения. Пронумеруйте посуду и мензурки 1, 2 и 3, чтобы избежать путаницы.

В стеклянной посуде 1 откройте мочевой пузырь офтальмологическими ножницами и разверните его с помощью щипцов и ложек делителя ядра. Промойте мочевой пузырь в стеклянном стакане 1 и поместите его в стеклянную посуду 2. Удалите прилипший жир на поверхности тканей с помощью щипцов и офтальмологических ножниц. Затем промойте мочевой пузырь в стакане 2 и поместите его в чашку 3.

Аккуратно соскребите мочевой пузырь с помощью щипцов и ложек делителя ядра, чтобы удалить экзогенные прикрепления. Промойте мочевой пузырь в стеклянном стакане 3 и переложите его в 15-миллилитровую центрифужную пробирку с 14 миллилитрами холодного раствора Кребса. Центрифугируйте образец в течение 1 минуты при 360 умноженных на g и 4 градусах Цельсия.

Переложите мочевой пузырь из центрифужной пробирки в 2-миллилитровый флакон, содержащий 1 миллилитр раствора для варежки. С помощью офтальмологических ножниц разрежьте мочевой пузырь на мелкие кусочки. Смешайте раствор мочевого пузыря с 9 миллилитрами раствора для пищеварения 1 в стерильной чашке для клеточных культур. Проведите первое вываривание в встряхивающем инкубаторе в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе при 200 об/мин. После первого разложения центрифугируйте раствор при 300-кратном g и 4 градусах Цельсия в течение 8 минут.

Тем временем поместите раствор для сбраживания 2 на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия для предварительного нагрева. После центрифугирования удалите большую часть надосадочной жидкости, содержащей раствор для разложения 1, оставив некоторое количество надосадочной жидкости для предотвращения потери клеток.

Ресуспендируйте клетки в теплом растворе для пищеварения 2 и встряхивайте смесь во время варки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 минут. Как только разложение будет завершено, немедленно деактивируйте трипсин, добавив 10 миллилитров холодной среды для полоскания. Центрифугируйте клетки при 360 умноженных на g и 4 градусах Цельсия в течение 8 минут. Затем удалите как можно больше надосадочной жидкости, чтобы устранить весь трипсин.

Аккуратно восстановите осадок с помощью 3 миллилитров нейронной среды, следя за тем, чтобы в растворе не образовывались пузырьки воздуха. Отфильтруйте суспензию через 70-микрометровый клеточный фильтр в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Соберите клетки центрифугированием при 360 умноженных на g при 4 градусах Цельсия в течение 8 минут. Затем аккуратно ресуспендируйте клеточные гранулы в 1 миллилитр нейронной среды А и добавьте по 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 48-луночного планшета. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.