Компартментализированная культура первичных нейронов мыши с использованием пластиковых микрофлюидных чипов

Возьмем пластиковый микрофлюидный чип, состоящий из соматических резервуаров и компартментов, а также аксональных резервуаров и компартментов, соединенных микробороздками.

Добавьте раствор для предварительного покрытия, чтобы пропитать отсеки и канавки, предотвращая попадание пузырьков воздуха.

Отсадите раствор, оставив основные отсеки заполненными. Постирайте с буфером.

Покройте лунки синтетическим полимером, который способствует адгезии нейронов. Промойте буфером и добавьте питательную среду, чтобы предотвратить высыхание чипа.

Чтобы засеять суспензию нейронов гиппокампа крысы, сделайте аспирацию среды.

Загрузите суспензию в соматические резервуары. Нейроны входят в соматический отдел и прикрепляются к нему.

Добавьте в лунки питательные среды для нейронов и инкубируйте. Факторы роста, присутствующие в среде, способствуют росту нейронов.

Постепенно нейроны расширяют свои аксоны, которые прорастают в аксональный компартмент через микробороздки.

Узость бороздок препятствует проникновению тел нейрональных клеток, обеспечивая физическое разделение соматической и аксональной областей.

Для начала поместите стерильный многокамерный чип в чашку Петри. Добавьте 100 микролитров раствора предварительного покрытия в верхнюю левую лунку чипа и дайте ему течь по основному каналу в соседнюю лунку. Далее заполните левую нижнюю лунку чипа 100 микролитрами раствора для предварительного покрытия.

На этот раз подождите пять минут, чтобы раствор протек через микробороздки. Теперь добавьте 100 микролитров раствора для предварительного покрытия в верхнюю правую лунку и дайте ему течь по основному каналу в соседний колодец. Через 90 секунд заполните нижнюю правую лунку 100 микролитрами раствора для предварительного покрытия, и выдержите чип в течение 10 минут.

Осторожно наклоните наконечник пипетки в сторону от основного канала и отсасывайте раствор из каждой лунки. Затем сразу же добавьте 150 микролитров PBS в верхнюю левую лунку и подождите 1,5 минуты. Затем добавьте 150 микролитров PBS в левый нижний лунец и подождите пять минут, чтобы жидкость протекла через микробороздки.

Затем добавьте 150 микролитров PBS в верхнюю правую и нижнюю правые лунки в указанном порядке. Через 10 минут снова отасуньте PBS и повторите шаги промывки во второй раз. После второй промывки аспирируйте PBS лунки, как и раньше, наклонив наконечник пипетки в сторону от отверстия канала.

Затем добавьте 100 микролитров 0,5 мг на мл раствора поли-D-лизина в верхнюю левую лунку чипа. Подождите 1 и 1/2 минуты, а затем заполните нижний левый колодец 100 микролитрами раствора поли-D-лизина. Повторите этот процесс на правой половине чипа. Закройте чашку Петри, затем поместите чип в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на один час.

После инкубации дважды промойте чипс PBS, как описано ранее. Далее отсасывайте PBS из прибора. Сразу же добавьте 100 микролитров среды для клеточных культур в верхнюю левую лунку чипа. Через 1 и 1/2 минуты добавьте медиа в левую нижнюю лунку.

Подождите пять минут, чтобы жидкость прошла через микроканавки, а затем повторите процесс заполнения с правой стороны чипа. Приготовьте клеточную суспензию диссоциированных нейронов гиппокампа крысы в соответствии с установленными протоколами. Удалите большую часть носителя из каждой лунки чипа, но оставьте каналы заполненными.

Далее сразу загрузите 5 микролитров клеточной суспензии в верхнюю правую лунку и еще 5 микролитров клеточной суспензии в нижнюю правую лунку. При загрузке ячеек направьте кончик пипетки в сторону основного канала. После загрузки клеток перенесите чип на столик микроскопа, чтобы убедиться, что нейроны находятся в основном канале.

Подождав 5 минут, пока клетки прикрепятся, добавьте примерно по 150 микролитров питательных сред нейронов в каждую из верхних и нижних правых лунок. Затем добавьте по 150 микролитров среды в каждую из верхних и нижних левых лунок. Накройте чашку Петри крышкой и поместите чипсы во увлажненный лоток в инкубатор с температурой 5% углекислого газа 37 градусов Цельсия.