Подготовка клиновидных срезов мозга для визуализации слуховых нейронов

Начните с мозга мыши и рассеките его горизонтально ниже задней части, чтобы сохранить слуховые нейроны, имеющие решающее значение для обработки звука.

Установите заднюю часть на магнитный диск. Поместите агаровый блок для стабилизации тканей во время разреза.

Перенесите срез в стадию срезной камеры вибратома, оснащенной лезвием.

Введите холодный буфер и пузырьковый газ карбоген, который обеспечивает кислород и сохраняет целостность нейронов.

Сделайте ровный горизонтальный надрез, чтобы удалить верхнюю часть участка мозга.

Затем наклоните сцену и продолжайте резать оставшуюся часть, пока не станет виден корешок слухового нерва.

Выровняйте сцену. Далее поверните его и отрегулируйте положение лезвия на нужную толщину тонкого края ломтика.

Отодвиньте лезвие в сторону и выровняйте столик в прежнее положение. Теперь разрежьте мозг в форме клина, толще с одной стороны и тоньше с другой.

Более толстая сторона включает в себя корешок слухового нерва, в то время как более тонкая сторона включает в себя взаимосвязанные слуховые нейроны.

Начните с использования лезвия бритвы, чтобы разрезать кожу по средней линии черепа от носа до задней части шеи. Снимите кожу, чтобы обнажить череп, и, начиная от основания черепа и продолжая к носу, с помощью маленьких ножниц сделайте разрез в черепе по средней линии.

На лямбда-шве сделайте надрезы в черепе от средней линии латерально к уху с обеих сторон, чтобы отклеить череп и обнажить мозг. Начиная с рострального конца, с помощью небольшого лабораторного шпателя аккуратно приподнимите мозг от черепа, чтобы можно было разорвать зрительные нервы.

Продолжайте мягко работать мозгом в обратном направлении, обнажая вентральную поверхность, и с помощью тонких щипцов осторожно зажмите тройничные нервы рядом с вентральной поверхностью ствола мозга, чтобы разрезать их. Поместите заготовку в стеклянную чашку Петри, наполненную холодным раствором для нарезки, и поместите чашку под препарирующий микроскоп. Обрежьте лицевые нервы, расположенные близко к стволу мозга, чтобы обнажить вестибулокохлеарные нервы.

С помощью тонких щипцов протолкните кончики отверстий, где вестибулокохлеарный нерв выходит из черепа как можно дальше. Ущипте, чтобы разорвать нервы с обеих сторон, оставив нервный корешок прикрепленным к стволу мозга.

Удалите мозговые оболочки и сосудистую сеть с вентральной поверхности ствола мозга рядом с трапециевидным телом. Затем пережмите оставшиеся черепно-мозговые нервы и соединительную ткань, чтобы полностью освободить мозг от черепа, стараясь по возможности сохранить оставшийся спинной мозг.

Чтобы подготовить поверхность мозга к креплению к сцене, поместите мозг вентральной стороной вверх и с помощью тупого инструмента аккуратно обездвижьте спинной мозг для стабилизации мозговой ткани. Вставьте открытые щипцы под углом примерно 20 градусов через мозг на дно посуды так, чтобы кончики выходили из дорсальной поверхности мозга каудально к зрительному хиазму, и используйте лезвие бритвы для разреза вдоль щипцов.

Далее приготовьте блок объемом в один кубический сантиметр из 4% агара и намажьте небольшую каплю клея в прямоугольник на сцене. С помощью щипцов осторожно приподнимите мозг и аккуратно промокните лишнюю жидкость краем бумажного полотенца. Затем поместите заблокированную поверхность на клей так, чтобы брюшная поверхность была обращена в направлении лезвия во время нарезки, и осторожно прижмите блок агара к тыльной поверхности в качестве опоры.

Чтобы получить клиновидные срезы с корешком кохлеарного нерва на толстой стороне и медиальным, оливокохлеарным нейронами и медиальным ядром трапециевидного тела на тонкой стороне, поместите магнитный диск с прикрепленным мозгом на держатель сцены и поместите держатель в камеру среза вибратома с вентральной поверхностью мозга, ориентированной к лезвию. Заполните камеру ледяным раствором для нарезки и опустите лезвие в раствор с карбогенами.

Разрежьте срезы каудально по отношению к интересующей области, чтобы убедиться, что срезы симметричны. Затем сдвиньте столик примерно на 15 градусов в одну сторону. Продолжайте осторожно резать до тех пор, пока корешок слухового нерва не окажется близко к поверхности с одной стороны, а лицевой нерв не будет виден на поверхности другой стороны среза.

Сдвиньте предметный столик на 15 градусов обратно в исходное положение, и отодвиньте лезвие от ткани. Поверните основание сцены на 90 градусов так, чтобы боковой край тонкой стороны был обращен к лезвию, и опустите лезвие на несколько сотен микрон, прежде чем медленно подвести лезвие близко к краю ткани. Слегка втянув лезвие, опустите лезвие до нужной толщины тонкого края ломтика.

Отодвиньте лезвие назад от ткани и поверните основание сцены назад так, чтобы брюшная поверхность была обращена к основанию сцены. Сделайте надрез, чтобы обозначить ростральную поверхность среза клина, и перенесите срез на лист сопряженной бумаги площадью один квадратный сантиметр. каудальная поверхность опущена.

Лицевой нерв должен быть виден на обоих полушариях разреза на ростральной поверхности. Затем переместите ломтик в инкубационную камеру с температурой 35 градусов Цельсия для восстановления в течение 30 минут.