Получение первичных культур ганглиозных клеток сетчатки из эмбрионов данио-рерио

Начните с ранней стадии развития эмбрионов данио-рерио в эмбриональных средах.

Удалите хорион, защитную мембрану, окружающую эмбрионы, и перенесите эмбрионы в свежую культуральную пластину, содержащую среду.

Удалите хвостовую часть эмбриона, затем отделите голову и аккуратно отделите глаза от головы.

Глаза содержат сетчатку, тонкий слой ткани, в котором находятся ганглиозные клетки сетчатки.

Перенесите глаза в пробирку, содержащую питательную среду для клеточных культур рыбок данио

.

Механически диссоциируйте глаза, чтобы освободить ганглиозные клетки сетчатки и сформировать одноклеточную суспензию.

Возьмите покровные листы, помещенные в культуральный планшет с питательными средами для рыбок данио

.

Покровные стекла покрыты синтетическим полимером и белком адгезии.

Перенесите ячейки в центр покровного стекла и инкубируйте.

Ганглиозные клетки сетчатки прикрепляются к покрытым поверхностям, и далее эти клетки развивают длинные выступы, называемые аксонами.

Достаньте эмбрионы рыбок данио из инкубатора и погрузите эмбрионы в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 70% этанола, на 5–10 секунд для стерилизации. С помощью пипетки для переноса перенесите эмбрионы в чашку E2 Media #1, содержащую стерильную среду E2, чтобы смыть излишки этанола. Затем перенесите эмбрионы в чашку E2 Media #2 и удалите их хорионы с помощью острых щипцов. Наконец, перенесите эмбрионы в чашку E2 Media #3 для проведения вскрытия.

С помощью пары тонких щипцов расположите и удерживайте эмбрионы перед желтком одним из щипцов, а хвост сзади желточного мешка удалите другими щипцами. Захватите шею щипцами и снимите голову, чтобы подвергнуть мозг и глаза воздействию среды Е2. Кончиком тонких щипцов осторожно закатите глаза от головы, удерживая черепную ткань вниз вторыми щипцами. Перенесите четыре глаза в одну из заранее подготовленных пробирок, содержащих ZFCM+.

Осторожно растирайте пипеткой P20 вверх и вниз около 45 раз, чтобы диссоциировать клетки. Перенесите ZFCM+ с диссоциированными ячейками в центр покровных стекол. Поддерживайте культуры на столе при температуре 22 градуса Цельсия, на стойке из пенополистирола для поглощения вибраций. В день визуализации проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить рост аксонов RGC.