Приготовление свободно плавающих культур срезов из мозга взрослого человека

Возьмем ткань человеческого мозга, погруженную в раствор для нарезки. Биологический pH и питательные вещества раствора помогают поддерживать функциональность тканей.

Удалите самый внешний слой мозговых оболочек и обрежьте ткань, чтобы создать плоскую поверхность.

Промокните лишний раствор из ткани. Приложите обрезанную ткань к диску для образцов с помощью агарозного блока, сохраняя контакт ткани с блоком для облегчения разрезания.

Поместите диск в буферный лоток для вибратома и накройте ткань ледяным раствором для нарезки.

С помощью вибратома генерируйте однородные срезы, которые сохраняют архитектуру ткани.

Обрежьте лишнюю ткань, обеспечив постоянную пропорцию серого и белого вещества.

Поместите ломтики в многолуночную тарелку, содержащую питательную среду, и инкубируйте.

Ломтики остаются подвешенными в среде, чтобы обеспечить равномерный доступ к питательным веществам, метод, известный как культура свободно плавающих ломтиков.

Регулярно пополняйте культуру средой, дополненной нервным фактором роста, для поддержания жизнеспособности тканей.

Переложите образец в чашку Петри с раствором для нарезки. С помощью тонких хирургических инструментов аккуратно удалите как можно больше оставшихся мозговых оболочек. Выберите наилучшую ориентацию образца для получения срезов с особыми характеристиками экспериментальной конструкции и используйте лезвие скальпеля номер 24 для обрезки плоской поверхности, которая будет

основой для диска образца.

С помощью одноразовой пластиковой ложки и тонких кистей для рисования соберите фрагмент из чашки Петри, а излишки раствора высушите фильтровальной бумагой. Затем с помощью суперклея прикрепите ткань к чашке для образца вибратома до тех пор, пока она не будет прочно приклеена к чашке и не соприкоснется с агарозным блоком.

Поместите диск с вибратомным образцом в буферный лоток вибратомии. Зафиксируйте держатель ножа на месте, плотно зафиксировав лезвие бритвы. Добавьте раствор для нарезки и убедитесь, что он покрывает как образец, так и лезвие. Затем начните нарезать образец на ломтики по 200 микрометров.

Переложите ломтики из буферного лотка в чашку Петри, содержащую раствор для нарезки, и обрежьте все свободные края и избыток белого вещества до пропорции примерно 70% коры и 30% белого вещества. В ламинарном проточном шкафу добавьте 600 микролитров питательной среды в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируйте при температуре 36 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение не менее 20 минут до нанесения покрытия на ломтики. После этого с помощью кисти выложите по одному ломтику в каждую лунку.

Если в тарелке есть неиспользованные лунки, заполните их 400 микролитрами стерильной воды. Инкубировать при температуре 36 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Дополните 10 миллилитров ранее приготовленной питательной среды нейротрофическим фактором мозга в концентрации 50 нанограмм на миллилитр.

Через 8-16 часов удалите по 333 микролитра кондиционированной среды из каждой лунки и добавьте 133 микролитра свежей среды, обогащенной BDNF. Заменяйте одну треть кондиционированной среды свежей средой с добавлением BDNF каждые 24 часа.