Выделение и культивирование микроглии из мозга крыс с использованием бессывороточных сред

Возьмем перфузированный мозг крысы. Измельчите его на мелкие кусочки.

Гомогенизируйте ткань в буфере для высвобождения клеток, включая микроглию.

Как только непереваренная ткань осядет, соберите надосадочную жидкость, содержащую клетки, и добавьте буфер для разделения миелина.

Смешайте содержимое и центрифугируйте для отделения клеток от миелина и мусора. Удалите слой миелинового мусора и надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте клетки в буфере и пипетке, чтобы разделить комки.

Пропустите суспензию через сетчатое фильтр, чтобы удалить оставшиеся клеточные агрегаты.

Перенесите отфильтрованные клетки в культуральную пластину, покрытую моноклональными антителами, специфичными для микроглии. Инкубируйте для облегчения адгезии микроглии.

Промойте буфером, чтобы удалить неадгезивные клетки. Добавьте трипсин и инкубируйте, чтобы ослабить микроглию.

Удалите трипсин.

Добавьте не содержащий сыворотки питатель. Инкубируйте на льду, чтобы ослабить взаимодействие клеток и субстрата.

Пипеткой и соберите суспензию в пробирку. Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте микроглию в среде, не содержащей сыворотки, и перенесите на многолуночную пластину, покрытую коллагеном. Инкубируйте для облегчения адгезии микроглии.

Добавьте среды с факторами роста и липидами. Инкубируйте для созревания микроглии.

После того, как мозги были собраны в холодном DPBS, измельчите каждый мозг на кусочки размером в один кубический миллиметр в чашке Петри на льду холодным лезвием скальпеля и переложите в ледяной гомогенизатор Dounce с 5-7 миллилитрами ледяного буфера. Затем используйте свободно прилегающий гомогенизатор Dounce, чтобы диссоциировать ткань с помощью 10-20 легких и неполных движений. Будьте осторожны, чтобы не раздавить непосредственно ткань на дне гомогенизатора. Вместо этого протолкните ткань через пространство между боковыми сторонами поршня и гомогенизатора.

Важно медленно гомогенизировать ткань с помощью нескольких раундов облучения, чтобы сохранить жизнеспособность микроглии.

После этого осторожно снимите поршень, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха. Дайте плохо диссоциированным тканевым фрагментам осесть на дно гомогенизатора и перенесите надосадочную жидкость в новую, охлажденную 50-миллилитровую коническую трубку. Затем замените удаленный объем свежим буфером и повторяйте процедуру диссоциации в общей сложности три-четыре раунда или до тех пор, пока вся ткань не будет диссоциирована.

В этой процедуре добавьте ледяной буфер в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую клеточную суспензию, и отрегулируйте общий объем до 33,5 миллилитров. Далее добавьте в клеточную суспензию 10 миллилитров MSB, и тщательно перемешайте, несколько раз перевернув трубку. В результате конечная концентрация MSB составит 23% в объеме 43,5 миллилитров.

После этого центрифугируйте клетки в течение 15 минут при 500 g при 4 градусах Цельсия с медленным торможением. Затем удалите верхний слой миелина, мусор и надосадочную жидкость с помощью пипетки. Будьте осторожны при снятии верхнего слоя, чтобы убедиться, что он удален как можно больше.

После этого повторно суспендируйте клеточную гранулу в 12 миллилитрах проволочного буфера. Аккуратно растирайте клеточную суспензию, чтобы разбить оставшиеся скопления клеток. На этом этапе пропустите клеточную суспензию через 70-микрометровый клеточный фильтр, чтобы удалить крупный мусор или клеточные комки. Трижды промойте форму, покрытую покрытием OX42, с помощью DPBS. Не допускайте полного высыхания пластины между стирками.

Слейте с себя последнюю промывку DPBS и нанесите отфильтрованную клеточную суспензию на форму для заготовок. Аккуратно покрутите пластину, чтобы распределить ячейки. Затем инкубируйте планшет на плоской поверхности при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы клетки прилипли. Не инкубируйте дольше 20 минут, иначе клетки будет очень трудно восстановиться после чашки. После этого промойте форму для замывки с помощью DPBS 10 раз, чтобы удалить неприлипшие клетки.

Микроглия будет прочно прикреплена к пластине, поэтому поворачивайте пластину при каждом полоскании, чтобы обеспечить удаление других неадгезивных клеток. Слейте последний ДПБС для стирки, и замените на 15 миллилитров ДПБС и 200 микролитров трипсина.

Чтобы трипсинизировать клетки, инкубируйте чашку менее или равную 10 минутам при температуре 37 градусов Цельсия. После 10 минут трипсинизации микроглия все еще будет прилипать к пластине. Слейте смесь и аккуратно промойте пластину два раза с помощью DPBS, чтобы удалить трипсин. Затем замените на 12 миллилитров ледяной MGM.

Затем поместите форму для дражирования на лед на две минуты, чтобы ослабить взаимодействие клеток и субстрата, и убедитесь, что чашка плоская, чтобы предотвратить высыхание участков формы для дражевания. После этого энергично пипетируйте с помощью 10-миллилитровой пипетки и контроллера пипетки на высокой скорости, чтобы извлечь клетки из проволочной чашки. Нарисуйте сетку 16 на 16 с потоком жидкости из пипетки, чтобы попытаться удалить все клетки.

Важно найти баланс между общим восстановлением клеток и здоровьем вашей культуры. Повторное пипетирование надосадочной жидкости клеточной жидкости на проволочной чашке приведет к снижению жизнеспособности вашей культуры.

Проверьте клетки под микроскопом при 20-кратном увеличении, чтобы убедиться, что они оторвались от пластины. Отметьте места в верхней части чашки, где застряли клетки, и повторите пипетирование в этих местах. Соберите клеточную суспензию и добавьте от 3 до 4 миллилитров надосадочной жидкости в каждую 15-миллилитровую коническую трубку. Крутите его в течение 15 минут при 500 g при 4 градусах Цельсия с медленным торможением.

Через 15 минут отсадите надосадочную жидкость, оставив 0,5 миллилитра MGM с клеточной гранулой. Затем повторно суспендируйте каждую гранулу в оставшемся MGM и объедините элементы из всех пробирок. После этого подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Теперь нанесите 15 микролитров коллагенового покрытия IV прямо в центр 24-луночного анионного планшета с катионным покрытием и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После подсчета клеток гемоцитометром разбавьте их до 2,3 х ^10-5 на миллилитр в MGM. Аспирируйте коллаген внутривенно и немедленно нанесите 15 микролитров клеточной суспензии в эту точку, чтобы получить 3,5 x 10³ клетки на место.

Затем инкубируйте в течение пяти-десяти минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы клетки прилипли. Затем аккуратно добавьте в лунку 500 микролитров CO2-уравновешенного ТИЦ.