Выделение и культивирование взрослых нейральных стволовых клеток из субкаллозальной зоны мыши

Начнем с мышиного мозга на охлажденной мозговой матрице.

Получите срезы, содержащие субкаллозальную зону или ЗКН. Переложите секцию в холодный фосфатный буфер.

Под препарирующим микроскопом вырезаем участок ЗКН.

Рассеченный ЗКН нарезать на более мелкие кусочки.

Переложите эти кусочки в буфер для разложения. Инкубируйте для диссоциации клеток из ткани.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в подходящей среде.

Перенесите клетки в культуральную тарелку и добавьте определенные факторы роста.

Взрослые нервные стволовые клетки делятся, образуя кластеры, называемые нейросферами.

Неправильное распределение питательных веществ в клеточных кластерах ограничивает рост клеток.

Чтобы диспергировать кластеры, центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Восстановите суспензию кластеров в буфере диссоциации и инкубируйте.

Пипетируйте раствор вверх и вниз, чтобы получить отдельные клетки.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте клетки и перенесите их в подходящую среду для получения монослоя.

После препарирования перенесите мозг мыши в холодный буфер PBS и дважды промойте его, чтобы удалить лишнюю кровь. Затем поместите мозг в мозговую матрицу на льду и сделайте корональные надрезы, чтобы получить срезы толщиной в один миллиметр. Впоследствии переведите задние срезы мозга, содержащие участки SCZ, в холодный PBS.

Под препарирующим микроскопом с малым увеличением микроскопом микродиспарируют ЗКН из области белого вещества коры и гиппокампа с помощью изогнутой иглы 30 калибра. Затем удалите области коры головного мозга над ЗКН и поместите рассеченные ЗКН в холодные ПБС в 35-миллиметровую чашку Петри на льду.

Область субкаллозальной зоны может быть точно рассечена из всей ткани с помощью мозгового матрикса и изогнутой иглы 30-го калибра.

После этого извлеките PBS, а затем, сразу же измельчите рассеченные ткани на мелкие кусочки. Повторно суспендируйте их одним миллилитром буфера для разложения. После этого переложите образец в 15-миллилитровую пробирку, содержащую два миллилитра буфера для сбраживания. Затем выдержите его в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

На этом этапе слегка постучите по пробирке, чтобы диссоциировать переваренную ткань, а затем центрифугируйте пробирку в 145 раз g в течение пяти минут. Через пять минут выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте переваренную ткань одним миллилитром предварительно подогретой и двумя средними для вымывания буфера для пищеварения, и аккуратно пипетируйте раствор образца максимум пять раз.

Затем снова центрифугируйте образец при 145 умноженных на g в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре среды N2. Поместите один миллилитр среды N2 в шестилуночный планшет без покрытия и добавьте один миллилитр взвешенных клеток, чтобы получить окончательный объем в два миллилитра.

Затем добавьте в каждую лунку 20 нанограмм на миллилитр ЭФР и 20 нанограмм на миллилитр bFGF. Осторожно встряхните чашку с шестью лунками вручную, чтобы смешать добавленные факторы роста с покрытыми клетками. Затем держите планшет с шестью лунками в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.

Добавляйте 20 нанограмм на миллилитр EGF и 20 нанограммов на миллилитр bFGF в каждую лунку каждый день в течение восьми дней. Каждые три дня добавляйте 200 микролитров среды N2, чтобы поддерживать примерно два миллилитра среды. Вот изображение нейросфер через восемь дней.

В ходе этой процедуры соберите нейросферы и перенесите их в новую 15-миллиметровую коническую трубку. Центрифугируйте пробирку при 145 раз g в течение пяти минут. Затем отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют нейросферы с 0,5 мл диссоциативного буфера. Инкубируйте их с 0,5 миллилитрами диссоциативного буфера в течение пяти минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы диссоциировать нейросферы на отдельные клетки.

Аккуратно пипетируйте раствор образца вверх и вниз менее пяти раз и центрифугируйте пробирку при 145-кратном g в течение пяти минут. Затем отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте нейросферы одним миллилитром среды N2. После покрытия шестилуночного планшета ламинином ФАПЧ, нанесите на клетки в соотношении 2,5 х 10⁵ клеток на миллилитр двумя миллилитрами среды N2 на лунку. Поддерживайте взрослые нейральные стволовые клетки SCZ с помощью ежедневной обработки факторами роста в течение пяти дней перед их удалением.