Получение зрелых органоидов мозжечка из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием одноразовых биореакторов

Засейте индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, или ИПСК, в биореакторе. ИПСК ресуспендируются в средах, содержащих клеточный ингибитор апоптоза.

Под действием магнитного поля вертикальное колесо биореактора вращается с контролируемой скоростью, облегчая межклеточный контакт и образование агрегатов. Удалите большую часть среды и добавьте свежую среду без ингибитора.

Продолжайте культивирование. Как только агрегаты достигнут оптимального размера, дайте им осесть под действием силы тяжести. Удалите среду.

Добавляют дифференцировочные среды, содержащие факторы роста, и культуру с уменьшенной частотой вращения колеса биореактора. Факторы роста способствуют нейронной дифференцировке внутри агрегатов.

Далее добавляют свежую среду с добавками факторов роста и хемокинами, индуцирующими развитие предшественников мозжечка.

Постепенно предшественники мозжечка организуются в отдельные слои внутри агрегатов, образуя ранние мозжечковые органоиды.

Наконец, добавьте нейронную среду, содержащую специфические нейротрофические факторы.

Эти факторы индуцируют созревание предшественника мозжечка в синаптически активные функциональные нейроны мозжечка, генерируя зрелые органоиды.

В день 1, когда день 0 является днем закладки биореактора, поместите биореактор и базовый блок в стерильный проточный колпак. Затем с помощью серологической пипетки соберите образец 1 миллилитра клеточной суспензии. Поместите клеточную суспензию в 24-луночный планшет со сверхнизким уровнем прикрепления. Используйте микроскоп, чтобы подтвердить, что образовались агрегаты, полученные из iPSC. Если это так, сделайте снимки агрегатов с 40-кратным или 100-кратным увеличением.

Продолжайте культивирование ИПСК в биореакторе до тех пор, пока средний диаметр агрегатов не составит 100 микрометров. Затем замените 80% среды свежим mTesR1 без ингибитора ROCK. Когда агрегаты достигнут диаметра от 200 до 250 микрометров, дайте всем органоидам осесть на дне биореактора. Затем замените всю отработанную среду средой для дифференцировки gfCDM.

Поместите базовый блок и биореактор в инкубатор и уменьшите перемешивание до 25 оборотов в минуту.