Выделение инфильтрирующих опухоль иммунных клеток из головного мозга мышей

Возьмем, к примеру, перфузию мозга мыши, содержащую опухоль.

На этапе перфузии удаляются циркулирующие иммунные клетки, но сохраняются инфильтрированные опухолью клетки.

Изолируйте ткань, содержащую опухоль.

Теперь механически диссоциируйте ткань.

Механическая сила разрыхляет ткани, высвобождая клетки.

Перенесите диссоциированную ткань в трубку.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую мусор.

Ресуспендируйте ткань в растворе для пищеварения, содержащем коллагеназу и ДНКазу.

Коллагеназа разрушает внеклеточный матрикс, высвобождая клетки. ДНКаза разрушает загрязняющую ДНК.

Добавьте буфер для остановки ферментативной активности.

Отфильтруйте суспензию, чтобы удалить клеточные агрегаты и получить одноклеточную суспензию.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в среде с высокой плотностью градиента. Теперь наложите на градиентную среду с более низкой плотностью, сформировав градиент разделения с понятной границей.

Центрифуга для разделения слоев. Иммунные клетки собираются на границе между градиентными средами, в то время как клеточный мусор плавает наверху.

Соберите иммунные клетки для дальнейшего анализа.

В этой процедуре, используя чистое лезвие бритвы с одним лезвием, изолируйте область мозга, содержащую опухоль, сделав сагиттальный разрез в центре мозга, чтобы разделить два полушария пополам. Поверните ипсилатеральное полушарие медиальной стороной вниз и сделайте один корональный разрез в мозжечке, а другой — в обонятельной луковице, чтобы изолировать ткань-мишень, содержащую опухолевый имплантат.

Затем поместите целевую ткань в маркированную шлифовальную машину, содержащую 1 миллилитр DPBS. Нажмите на поршень до упора и поверните семь раз, чтобы нарушить ткань. После этого поднимите поршень, чтобы жидкость осела обратно на дно измельчителя тканей. Повторите этот шаг трижды. Тем не менее, поворачивайте поршень только четыре раза во время следующих двух повторов и три раза во время последнего повтора, чтобы избежать чрезмерного растирания мозговой ткани.

Затем нанесите три 1-миллилитровых объема ледяного DPBS на боковые стороны поршня, чтобы промыть остатки мозгового вещества в тканевую измельчительную машину. Затем повторно суспендируйте растиранное вещество мозга с помощью пипетирования вверх и вниз и поместите в промаркированную 15-миллилитровую центрифугу на льду. Промойте боковые стороны измельчителя тканей DAPS дополнительным 1 миллилитром ледяного DPBS и добавьте в ту же 15-миллилитровую центрифужную пробирку.

Держите все пробирки с растиранным мозговым веществом на льду, пока не будут обработаны все образцы. Затем раскрутите растиранное мозговое вещество в 15-миллилитровых центрифужных пробирках в 740 раз больше g в течение 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Далее удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулированное вещество мозга в 1 миллилитре заранее приготовленной смеси коллагеназы и пищеварительных ферментов ДНКазы I.

Поместите 15-миллилитровые центрифужные пробирки в штатив для пробирок и поместите штатив на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут, затем осторожно перемешивайте образцы дважды в течение инкубационного периода, переворачивая пробирки для облегчения дезагрегации тканей.

Впоследствии добавьте по 6 миллилитров ледяного DPBS в каждую трубку, чтобы разбавить пищеварительные ферменты. Пипетку вверх и вниз до упругости и отфильтруйте весь объем через стерильные 70-микронные нейлоновые сетчатые фильтры в новые 15-миллилитровые центрифужные пробирки со льдом с маркировкой.

После этого вращайте суспензию клеток мозга в 740 раз больше g в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы получить одноклеточную гранулу. Извлеките 15-миллилитровые пробирки из центрифуги и положите их на лед. Затем увеличьте температуру на центрифуге примерно до 21 градуса Цельсия, готовясь к следующему шагу.

Затем полностью удалите надосадочную жидкость клетки и первоначально ресуспендируйте клеточные гранулы в 1 миллилитре центрифугирующей среды 70% плотности с помощью микропипетки P1000. Затем добавьте в каждую пробирку еще четыре миллилитра центрифугирующего материала 70% плотности. Надежно наденьте колпачки и гомогенизируйте клеточную суспензию, осторожно перевернув пробирку несколько раз.

После этого перенесите 15-миллилитровые центрифужные пробирки, содержащие клетки мозга, ресуспендированные в центрифугирующей среде 70% плотности, изо льда в пробирку обратно при комнатной температуре. По одному за раз аккуратно нанесите 2 миллилитра раствора центрифугирующего материала 37% плотности на 5 миллилитров центрифугирующего материала 70% плотности, чтобы образовалась чистая граница раздела между двумя слоями центрифугирующего материала.

Затем отметьте положение границы раздела между двумя слоями маркером с тонким наконечником, чтобы его можно было легко идентифицировать после центрифугирования, когда различие становится менее заметным. Раскрутите 15-миллилитровые центрифужные пробирки при 740-кратном избытке в течение 20 минут при комнатной температуре без перерыва, чтобы не нарушить границу раздела между слоями центрифугирующей среды.

После этого соберите PBMC, которые накопились на границе между двумя слоями центрифугирующей среды плотности, введя микропипетку P200 в пробирку, осторожно обходя липидный слой. Оказавшись на уровне полосы PBMC, медленно извлеките 200 микролитров с поверхности слоя центрифугирующего материала плотностью 70% и перенесите в соответствующую маркированную полипропиленовую пробирку FACS на льду. Повторите этот шаг один раз, чтобы достичь общего объема 400 микролитров на образец.