Селективное удаление микроглии из культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы

Возьмите собранный мозжечок крысы и разрубите его на фрагменты.

Перенесите фрагменты в пробирку, содержащую трипсин, и инкубируйте.

Трипсин переваривает внеклеточный матрикс ткани, ослабляя гранулярные нейроны мозжечка, а также ненейрональные клетки, такие как микроглия и астроциты.

Добавьте буфер, содержащий ингибитор трипсина и ДНКазу. Ингибитор инактивирует трипсин, в то время как ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте ткань в буфере, содержащем ингибитор и ДНКазу, и механически диссоциируйте ее с образованием одноклеточной суспензии.

Наложите суспензию на содержащий белок буферный раствор.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую клеточный мусор.

Ресуспендируйте клетки в среде и засейте их на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином, чтобы облегчить прикрепление клеток.

Извлеките носитель. Промойте клетки свежей средой, а затем добавьте среду, содержащую ингибитор клеточного цикла для предотвращения пролиферации глиальных клеток.

Замените половину среды свежей средой, содержащей ингибитор лизосом.

Ингибитор избирательно воздействует на микроглию и разрушает лизосомальные мембраны, вызывая гибель микроглии и удаление из культуры.

Начните эту процедуру со сбора мозжечка от четырех-семидневных крысят. Поместите их сразу в чашку Петри, содержащую пять миллилитров раствора А на льду. Затем удалите излишки раствора из мозжечка и поместите ткань в крышку чашки Петри. Далее мелко нарежьте ткань хорошо прокаленным лезвием бритвы как минимум в трех разных направлениях.

Впоследствии добавьте измельченную ткань в раствор В. Поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут, и аккуратно встряхивайте каждые пару минут. Затем добавьте в тюбик 20 миллилитров раствора D, чтобы нейтрализовать трипсин. Встряхните и центрифугируйте при 65 г в течение пяти минут. После этого слейте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте его в четырех миллилитрах раствора С.

Измельчите образец 10 раз с помощью каждой из трех дозаторов из обожженного стекла уменьшающегося диаметра до тех пор, пока суспензия не станет максимально однородной. Затем медленно и аккуратно добавьте несколько капель этого гомогената поверх BSA-EBSS. Если он начинает просачиваться через BSA-EBSS, растираем еще и добавляем еще немного раствора С. Гомогенат должен находиться слоем поверх BSA-EBSS.

Крутите его при 100 г в течение пяти минут, и не встряхивайте. Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды MEM. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и поместите их в 800 000 клеток на покровное стекло в 500 микролитр среды MEM. После этого поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 6% углекислым газом. Затем приготовьте раствор МЭМ-среды, содержащей 10 микромоляров ингибитора клеточного цикла AraC.

Для каждого покровного стекла сохраните 250 микролитров старой среды в свежей 24-луночной пластине и аспирируйте оставшуюся часть. Добавьте 250 микролитров обычной среды MEM для промывания клеток. Затем добавьте 250 микролитров старой среды обратно в ячейки, и долейте 250 микролитров среды, содержащей AraC.

В этой процедуре добавьте чистую LME к пяти миллилитрам среды MEM, чтобы получить конечную концентрацию 150 миллимолярных LME. Верните раствор к pH 7,4 с помощью кислотно-щелочного раствора. Затем стерильно отфильтруйте его с помощью 28-миллиметрового PES со шприцевым фильтром 0,2 микрометра.

Далее раствор LME разбавляют до концентрации 50 миллимоляров в среде MEM. Затем поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут вместе с обычной средой MEM для контрольных культур. Через 10 минут удалите по 250 микролитров среды MEM из каждой культуры CGC. Затем удерживайте среду при температуре 37 градусов по Цельсию.

Затем обрабатывают клетки средой MEM, содержащей в два раза больше LME, или предварительно подогретой средой MEM без LME для контрольных культур. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 6% углекислым газом в течение одного часа. После этого дважды промойте элементы в свежей предварительно подогретой среде MEM, чтобы удалить среду, содержащую LME.

Затем замените сохраненную питательную среду равным количеством свежей предварительно подогретой МЭМ-среды. Наконец, инкубируйте культуры в 6% увлажненном углекислом газе при температуре 37 градусов Цельсия.