Селективное удаление микроглии из культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы

Возьмите собранный мозжечок крысы и разрубите его на фрагменты.

Перенесите фрагменты в пробирку, содержащую трипсин, и инкубируйте.

Трипсин переваривает внеклеточный матрикс ткани, ослабляя гранулярные нейроны мозжечка, а также ненейрональные клетки, такие как микроглия и астроциты.

Добавьте буфер, содержащий ингибитор трипсина и ДНКазу. Ингибитор инактивирует трипсин, в то время как ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте ткань в буфере, содержащем ингибитор и ДНКазу, и механически диссоциируйте ее с образованием одноклеточной суспензии.

Наложите суспензию на содержащий белок буферный раствор.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую клеточный мусор.

Ресуспендируйте клетки в среде и засейте их на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином, чтобы облегчить прикрепление клеток.

Извлеките носитель. Промойте клетки свежей средой, а затем добавьте среду, содержащую ингибитор клеточного цикла для предотвращения пролиферации глиальных клеток.

Замените половину среды свежей средой, содержащей ингибитор лизосом.

Ингибитор избирательно воздействует на микроглию и разрушает лизосомальные мембраны, вызывая гибел